互助縣牦牛病毒性腹瀉病檢驗以及鑒定

陶延慶

青海省海東市互助縣畜牧獸醫站，青海海東 810500

BVDV作為一種單股正鏈的RNA病毒，屬黃病毒科，瘟病毒屬，與豬瘟病毒和綿羊邊界病毒同屬[1]。BVDV主要感染動物為牛，也對羊、豬、鹿等動物有感染力[2]。根據BVDV感染細胞后是否會產生病變，BVDV可以分為細胞病變型(CP)和非細胞病變型(NCP)。根據5’UTR可以將病毒分為2個基因型，BVDV-1型，BVDV-2型。我國存在多個基因亞型，且目前我國主要流行的基因型為BVDV-1b型。該類疾病在全世界范圍內流行十分廣泛，造成了很大的經濟損失。這種疾病可以導致母牛出現流產，胎兒發育不健康，腹瀉等一系列癥狀。如孕?；加性摬鹣乱淮呐俪霈F持續性感染，持續性感染的動物終身攜帶病毒，且血清學結果為陰性，不斷地污染周圍的環境，造成病毒的擴散[3]。這樣的傳播模式也使得BVDV的防治十分的困難，本試驗通過對腹瀉的牦牛進行ELISA抗體檢測，PCR鑒定對疾病進行鑒定，為了更好的防治互助縣牦牛疾病做出貢獻。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 發病動物情況

互助縣某牦牛養殖戶養殖的兩頭持續腹瀉的牦牛，該養殖戶養殖的牦牛均未接種BVDV疫苗。

1.1.2 樣本采集采集兩頭發病牦牛的血清2 mL進行ELISA檢測并命名為1、2，糞樣與血清樣本命名一致。

1.1.3 試劑

BVDV ELISA抗體檢測試劑盒購自愛德士生物制品有限公司。RNA提取試劑盒購自北京天根生物制品有限公司。反轉錄試劑以及PCR試劑均購自北京康為世紀有限公司。

1.1.4 引物

BVDV引物根據張國華等[4]的文章中方法進行設計，由上海生工有限公司進行合成。引物名稱，引物序列以及片段大小見表1。

表1 BVDV 5’UTR引物

1.2 方法

1.2.1 BVDV ELISA檢測

BVDV抗體ELISA檢測方法按照愛德士生物制品有限公司提供的說明書進行操作，并根據說明書判讀檢測結果。

1.2.2 PCR鑒定

2例糞便樣本按照天根RNA提取試劑盒說明書進行操作，提取出兩例樣本，測定RNA濃度后，使用北京康為世紀的試劑盒進行反轉錄，獲得cDNA，進行PCR擴增，操作程序以及體系按照張國華文章[4]中的步驟進行操作，獲得PCR產物在凝膠成像系統下進行分析。

1.2.3 測序

將擴增到的PCR產物送至上海生工有限公司進行測序，測序結果與GENEBANK數據進行對比。

2 結果

2.1 ELISA檢測結果

2例血清樣本按照愛德士生物制品有限公司生產的BVDV抗體ELISA檢測試劑盒進行檢測，陰性對照孔、陽性對照孔符合實驗結果，1號、2號樣本ELISA檢測結果顯示為陽性。

2.2 PCR鑒定結果

取1號、2號糞便樣本，進行RNA提取，反轉率，5’UTR PCR鑒定，擴增的產物進行凝膠電泳鑒定，結果顯示陰性對照無條帶，1號、2號樣本擴增出條帶為279 bp的特異性條帶（見圖1），將擴增片段的測序結果在GENEBANK上進行對比結果顯示與美國SD-1株同源性分別為95.7%、96.2%，顯示這兩例BVDV為BVDV-1型。

3 討論

牛病毒性腹瀉病在我國以及全世界范圍內發生感染的情況已經十分廣泛，尤其是對于我國畜牧業發達的省份影響更加巨大[5，6]。2015年蔡元慶等人[7]對新疆部分地區的174份疑似BVDV感染樣本進行了檢測，將檢測到的陽性樣本接種于MDBK細胞中可以使細胞發生病變（CPE），并且擴增出了5’UTR片段，結果證實分離到的病毒屬于BVDV-1型。2018年陳新諾[8]對于川藏地區的149份牦牛糞便樣本進行了牛病毒性腹瀉流行病學調查，結果顯示陽性率為19.46%，其中西藏地區陽性檢出率為27.14%，四川地區陽性率為12.66%。2019～2020年間杞艷萍[9]對我國西部地區的17個奶牛場，1 234份樣本通過5’UTR片段進行檢測，結果顯示樣本總陽性率為7.2%，17個牛場中有14個牛場檢測到了陽性樣本。本試驗對于互助縣某牦牛養殖戶的腹瀉牛進行BVDV抗原ELISA檢測以及5’UTR片段進行鑒定結果顯示，兩例腹瀉牛均為BVDV感染陽性牛，且屬于BVDV-1型樣本。因此，在后續的養殖過程中需要加強防疫，做好對牦牛群的疫苗免疫至關重要。

據有關報道，西北地區流行過的BVDV-1型病毒[10]，有的5’UTR序列也是和美國的SD-1株同源性較高,隨著西北地區肉牛、牦牛養殖業的不斷發展，動物不斷地交易，引種可能很大程度上導致牛病毒性腹瀉病的流行，造成經濟損失。BVDV是危害養牛業健康發展最為重要的病原之一。近年，由于跨國家、地區引種的增加及跨區域調運的頻繁，我國多個地區發現了BVDV流行，給養牛業造成了巨大的經濟損失，有必要加大對新型毒株的監測和預警。目前，通過分子手段檢測病毒，并對其進行分離的鑒定，可以更加準確的診斷BVDV。

本研究在兩例腹瀉牛糞便中分離到了BVDV-1型病毒，為互助縣牦牛對牛病毒性腹瀉疾病的防控提供了很好的理論依據，為本地區對于BVDV如何更好的防控，以及后續的研究方向提供了指導以及參考。牛病毒性腹瀉目前有多個基因型，目前市面上的疫苗比較單一，缺乏更加全面的疫苗對該類疾病進行防控。當發生疾病時主要還是要加強對病畜進行隔離，對癥治療，不要盲目的使用抗生素類藥物，以免發生耐藥性。日常飼養中要加強對牦牛群體的日常管理，強化獸醫工作人員以及養殖戶對于牛病毒性腹瀉類疾病的了解和認識，做到早發現、早治療，減少不必要的經濟損失。養殖戶日常的養殖過程中要加強牛只進出的管理，最好做到全進全出，自繁自養的模式，如有必要進行引種的情況下，要按照相關的規定做好檢測和隔離，確定引入的牛只無疫病的情況下才能混入牛群?？茖W的飼養模式可以增加養殖牦牛的收益，減少疾病的發生，減少經濟損失，讓養殖戶在飼養的道路上發展的越來越好。希望大家共同努力，為互助縣畜牧業美好的明天做出貢獻。