次氯酸鈉溶液對南瓜表面微生物的殺菌條件探索

莊孝飛，顧文佳，顧晟琳

（上海市質量監督檢驗技術研究院，上海 200233)

南瓜（）是人們生活中最常見的蔬菜之一，具有豐富的營養價值和較高的藥用價值。近年來，國內外學者對南瓜的化學成分、藥理作用和臨床應用進行了較多的研究，證明南瓜含有多種藥理活性成分，是開發各種保健食品和藥品的寶貴資源。王勝杰等利用氣相色譜法測定出南瓜中含有豐富的肌醇，其具有改善細胞營養，降低血脂，抑制膽固醇的生成及動脈硬化等作用。孔慶勝等研究表明，南瓜多糖是較理想的能改善脂類代謝的食療劑。徐國華等研究表明，南瓜具有一定的抗癌及升高血漿白細胞、淋巴細胞的作用和增強紅細胞免疫吸附的功能。南瓜作為一種防治糖尿病的特效營養保健食材，備受人們的青睞。

我國是南瓜的主產國之一，但是新鮮南瓜水分含量較高、不易儲存，若加工銷售不及時、儲存運輸條件不當，都會造成南瓜的腐爛和損耗。南瓜腐爛主要由微生物引起，發霉腐爛是影響南瓜品質的主要因素之一。機械傷害，更易發生品質劣變和微生物侵染。因此，安全、衛生地儲存南瓜，同時有效保持其營養價值是目前的研究熱點。

有效氯是當前最常用的消毒劑之一，采用有效氯對南瓜表面進行消毒是一種簡便、經濟、有效的采后處理方法；然而，目前尚缺乏對消毒劑濃度和消毒時間的研究證據。本研究將探索次氯酸鈉溶液最佳有效殺菌濃度和浸泡時間，并通過回接侵染試驗確認優勢霉菌，驗證最佳有效氯濃度的次氯酸鈉溶液的殺菌效果，以期為降低南瓜表面微生物侵染風險，延長南瓜的貯藏時間提供依據，同時為南瓜等新鮮果蔬的前處理手段提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與設備

供試南瓜品種為“皇家一號”（上海曹野農業發展有限公司種植）。試劑有：次氯酸鈉滴定溶液（0.5 mol/L，北京盛世康普化工技術研究院）；營養瓊脂培養基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）、孟加拉紅培養基、沙氏培養基（北京陸橋技術股份有限公司）；高鹽察氏培養基（廣東環凱微生物科技有限公司）；Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒、SanPrep柱式膠回收試劑盒等分子生物學試劑（生工生物工程（上海）股份有限公司）。

設備有5430R型臺式冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；KBF240霉菌培養箱（德國Binder公司）；VERITI梯度PCR儀（美國ABI公司）；Geldoc XR＋型凝膠成像系統（美國Biorad公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 次氯酸鈉溶液對新鮮南瓜表面的殺菌效果試驗

1.2.1.1 新鮮南瓜表面的菌落總數統計 選取27個新鮮南瓜，分別標記序號后，用棉棒反復涂抹南瓜尾部表面，涂抹面積為10 cm。將棉棒置于10 mL無菌生理鹽水中，混勻后進行10倍梯度稀釋，分別吸取0、10、10、10稀釋液1 mL于無菌平皿中，傾注營養瓊脂培養基，冷凝后倒置于37 ℃恒溫培養箱中培養（48±2）h，計數菌落，統計每個南瓜表面10 cm內菌落總數值，作為對照。

1.2.1.2 消毒新鮮南瓜表面的菌落總數統計 將上述27個涂抹過的南瓜進行消毒處理，每3個南瓜為1組，共9組。采用有效氯濃度為50、200、1 000 mg/kg的次氯酸鈉溶液，分別浸泡3、5、10 min。將浸泡后的南瓜晾干，分別在1.2.1.1所述南瓜10 cm表面相近部位（尾部）再次用棉棒反復涂抹10 cm大小的區域，檢測菌落總數，方法同1.2.1.1。

計算殺菌率，殺菌率＝（新鮮南瓜表面的菌落總數－消毒南瓜表面的菌落總數）／新鮮南瓜表面的菌落總數×100%。

1.2.2 腐爛南瓜中優勢霉菌的分離與純化

將從已腐敗的南瓜中分離出的各種霉菌分別接種至PDA培養基和孟加拉紅培養基上，28 ℃培養5～7 d，從中挑取5株具有典型特征的腐敗霉菌進行分離純化。用無菌剪刀在新鮮南瓜表面上剪出1 cm×1 cm大小的傷口，將分離純化的霉菌分別回接至南瓜表面大小為1 cm ×1 cm的傷口上，以接種無菌水為對照，常溫貯藏3～5 d，觀察傷口處的霉菌生長情況，確定優勢腐敗霉菌。將分離的優勢霉菌接種于高鹽察氏培養基上，28 ℃培養3～7 d，觀察并記錄霉菌在培養基上的形態特征，包括菌落特征以及菌絲體生長狀況等。同時，提取優勢腐敗霉菌分離株DNA，通過PCR技術獲得優勢腐敗霉菌rDNA-ITS序列，并使用NCBI進行序列相似度比對，從而鑒定優勢霉菌種類。

1.2.3 最佳殺菌條件對腐爛南瓜中優勢霉菌的最佳殺菌效果

將優勢霉菌g1、w2、w3分別接種至PDA培養基上，28 ℃條件下培養5～7 d，用0.9%的生理鹽水將孢子洗至無菌三角瓶中（內裝滅菌玻璃珠），搖勻、過濾出菌絲體，分別制備濃度為2.0×10、2.6×10、6.0×10個/mL的孢子懸液。取已消毒的9個新鮮南瓜，每3個南瓜為1組，共3組。分別標記序號后，在南瓜表面劃出10 cm大小的區域，將0.1 mL孢子懸液均勻涂至該區域上，晾干；再經1.2.1方法中得出的最佳濃度次氯酸鈉溶液和浸泡時間處理后，晾干，用棉棒反復涂抹該區域，回收南瓜表面的孢子。將棉棒置于10 mL無菌生理鹽水中，混勻，并進行10倍梯度稀釋，取0、10、10、10稀釋度各1 mL于無菌平皿中，傾注沙氏培養基，冷凝后28 ℃下培養5～7 d，計數霉菌。計算殺菌率，殺菌率＝（初始涂至南瓜表面的霉菌孢子數值－消毒處理后回收南瓜表面的霉菌孢子數值）／初始涂至南瓜表面的霉菌孢子數值×100%。

1.3 數據統計分析

殺菌率作為計量資料采用mean±SD進行統計描述。考慮到3次平行試驗條件結果的相關性，同一浸泡時間不同有效氯濃度進行比較，同一有效氯濃度不同浸泡時間進行比較，采用線性混合模型（linear mixed model）進行分析，得到最佳殺菌條件（有效氯濃度和浸泡時間）組合。采用SAS 9.4統計軟件進行差異分析。

2 結果與分析

2.1 次氯酸鈉溶液對南瓜表面的殺菌效果

如表1所示，在不同浸泡時長下，隨著有效氯濃度的升高，殺菌率也隨之升高（＜0.05）。在10 min浸泡時長下，有效氯50 mg/kg與有效氯200 mg/kg溶液的殺菌率差異的值處于0.05臨界（＝0.044 9），有效氯200 mg/kg與有效氯1 000 mg/kg溶液的殺菌率無統計學差異（＝0.705 7）。在有效氯200 mg/kg和有效氯50 mg/kg濃度下，隨浸泡時間的延長，殺菌率也隨之升高（＜0.05），在有效氯1 000 mg/kg濃度下，殺菌率達到高峰，不同浸泡時間下的殺菌率差異無統計學差異（＞0.05）。兼顧食品營養品質和感官質量，在達到一定殺菌效果的同時盡量采用較低濃度次氯酸鈉溶液；因此，本試驗確定最佳消毒條件為有效氯200 mg/kg的次氯酸鈉溶液浸泡10 min，南瓜表面的殺菌率達到99.53%。

表1 不同有效氯濃度、不同浸泡時間南瓜表面殺菌率

2.2 腐爛南瓜中優勢霉菌的分離與純化

經培養后，腐爛南瓜表面上的霉菌在2種培養基上生長出形態各異的霉菌。從中挑取5株具有典型特征的腐敗霉菌分離純化并進行回接后，有3株霉腐的菌絲生長旺盛，侵染較快，1個月后南瓜傷口處已腐敗潰爛（圖1），由此確認這3株霉菌為優勢腐敗霉菌，其形態特征如表2所示。

圖1 優勢腐敗霉菌回接侵染試驗

分別以菌株g1、w2、w3基因組DNA為模板，采用真核生物ITS通用擴增引物進行特異性擴增，獲得609、565、586 bp的ITS片段的PCR產物，經電泳檢測，3個分離株ITS基因擴增片段如圖2所示。N C B I序列相似度比對結果如表2所示，鑒定得出3株霉腐，分別是黑曲霉（）、西瓜蔓枯病菌（）、芽枝霉屬（）。

圖2 優勢菌株g1、w2、w3的ITS序列電泳檢測結果

表2 優勢腐敗霉菌的形態特征、ITS序列鑒定及NCBI比對結果

2.3 最佳殺菌條件對腐爛南瓜表面優勢霉菌的殺菌效果

如表3所示，在有效氯200 mg/kg的次氯酸鈉溶液浸泡10 min的殺菌條件下，對腐爛南瓜表面優勢霉菌g1、w2、w3的殺菌率均在99.1%及以上，殺菌效果顯著。

表3 最佳殺菌條件對優勢霉菌的殺菌率

3 結論與討論

南瓜的保鮮儲存問題一直是國內外學者關注的重點，研究表明南瓜最佳儲存環境為10 ℃左右，濕度不超過80%，通風、防碰傷。一旦出現傷口，則容易腐爛。本研究發現，南瓜最先出現腐爛的部位一般都在瓜蒂和尾部，還有采摘運輸中形成的傷口位置。因瓜蒂和傷口有破損，微生物易侵入，外加濕熱的儲存環境，會加速南瓜的腐爛。在采收后及時對南瓜表面進行消毒，去除有害易致腐微生物，將是簡單有效且經濟實用的延長南瓜貯藏時間的方式之一。

本研究表明，采用次氯酸鈉溶液對南瓜表面消毒，能夠有效殺滅南瓜表面大部分微生物。經線性混合模型分析，并考慮到食品營養品質和感官質量，南瓜采后處理盡量在達到一定的殺菌效果的同時采用低濃度消毒溶液，因此得到殺菌條件組合為：有效氯200 mg/kg的次氯酸鈉溶液浸泡10 min，對南瓜表面的殺菌率可達到99.53%。這與方宗壯等的研究結果相似，經200 mg/kg次氯酸鈉溶液處理的鮮切菠蘿能更好地保持產品品質，延長貯藏時間。

劉程惠等從腐敗的蘋果中分離出優勢腐敗霉菌黑曲霉。陳悅等從發病西瓜葉片上獲得334株西瓜蔓枯病菌。何祎對邳州地區霉腐蒜頭的微生物進行了分離鑒定，確定腐霉的種類主要為芽枝霉菌、黑霉菌等。本研究從腐敗南瓜中分離純化出的優勢霉菌為黑曲霉（）、西瓜蔓枯病菌（）和芽枝霉屬（），可引起多種食品腐敗變質，這為后續食品貯藏中腐敗微生物的防治提供了有力的信息支持。將分離得到的3種優勢霉菌分別接種至新鮮南瓜后，經本研究探索出的最佳殺菌條件進行處理，殺菌率依然在99.1%及以上，證明該最佳殺菌條件對南瓜表面的腐敗霉菌能夠起到很好的消殺作用。

綜上，有效氯200 mg/kg的次氯酸鈉溶液浸泡10 min是本研究探索出的最佳殺菌條件；該殺菌條件對腐敗霉菌的殺菌效果得到了驗證，能夠對南瓜表面微生物包括細菌和腐敗霉菌起到良好的消殺作用，可作為采后南瓜表面殺菌的有效手段。