何首烏提取物大鼠體內組織蓄積比較研究△

汪祺，楊建波a，王瑩，李妍怡，2，馬雙成*，張玉杰

1.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；

2.北京中醫藥大學，北京 100029

何首烏是蓼科植物何首烏Polygonum multijiorumThunb.的干燥塊根，主要成分包括蒽醌類（大黃素、大黃素甲醚、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷等）、二苯乙烯苷類（2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-D-葡萄糖苷）和鞣質（沒食子酸、兒茶素等）等[1]。目前對于何首烏致肝毒性的物質成分的研究主要集中在蒽醌類（此類研究多認為二苯乙烯苷類成分無肝毒性）[2-4]和二苯乙烯苷類（此類研究多認為蒽醌類成分無肝毒性）成分[5-6]，另有少量研究則認為鞣質具有肝毒性[7]。由于大黃、決明子和虎杖等中藥材都含有豐富的蒽醌類成分，卻少見肝毒性報道，何首烏肝毒性成分難以確認。目前毒性成分研究存在的另一個問題是，研究主要基于體外細胞實驗，對于長期給藥后體內成分累積和暴露情況缺乏了解。組織中藥物的蓄積是造成該組織毒性的重要前提條件，尤其是在長期給藥的情況下。另外成分間的相互作用也是需要考慮的因素，因而研究藥物化學成分在體內各組織的分布和蓄積對于探索何首烏肝毒性具有重要的意義。

本研究對連續灌胃42 d 何首烏70%乙醇提物（PME）和水提物（PMW）的大鼠肝、腎、血漿和膽汁樣品中大黃素，大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷和二苯乙烯苷進行了定量分析，考察這些成分在大鼠體內的蓄積狀況，旨在進一步闡明何首烏可能的肝毒性成分。

1 材料

1.1 儀器

ACQUITY UPLC/XEVO TQ-S 型超高效液相色譜串聯四級桿質譜儀（TQ-S 型四級桿質譜，美國Waters 公司）；電噴霧電離源（ESI）；MassLynx V4.1 數據處理系統；Sartorius BS 110 型電子分析天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；TGL20M 型高速冷凍離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司）；KQ-300B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；VORTEX GENIVS 3 型漩渦混勻儀（美國Scientific Industries 公司）；MTN-2800D 型氮氣吹干儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

1.2 試藥

何首烏飲片（北京本草方源藥業有限公司，批號：20160414）；乙腈、甲醇（色譜純，美國Fisher公司）；甲酸（色譜純，美國MREDA 公司）；超純水；其他試劑均為分析純。

對照品二苯乙烯苷（批號：110844-202116，純度為94.8%）、大黃素（批號：110756-201512，純度為98.7%）購自中國食品藥品檢定研究院；大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷（批號：B20241，純度≥98%）、1,8-二羥基蒽醌（批號：B21740，純度≥98%）均購自上海源葉生物科技有限公司；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，美國Sigma 公司，純度為99.0%）。

1.3 實驗動物

無特定病原體（SPF）級Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠30 只，體質量（200±20）g，購于斯貝福（北京）實驗動物科技有限公司，許可證號：SCXK-2011-0004。標準動物房中飼養，室溫22～24 ℃，相對濕度55%～60%，光照12 h 時明暗交替，喂以SPF級標準飼料。經國家藥物安全評估中心（NCSED）機構動物護理和使用委員會（IACUC）批準，批準號為IACUC-2017-K023。

2 方法

2.1 色譜質譜條件

AcQuity UPLC ?BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8μm，美國Waters 公司）；流動相為乙腈（A）-5 mmol·L-1乙酸銨（B），pH=7.5，梯度洗脫（0～1 min，80%B；1～6 min，80%～15%B；6～7.5 min，15%B；7.5～8 min，15%～80%B；8～10 min，80%B）；柱溫：30 ℃；流速：0.3 mL·min-1；進樣量：1 μL；樣品架溫度：10 ℃。

質譜條件：負離子檢測模式；毛細管電壓：2500 V；錐孔氣流速：50 L·h-1；脫溶劑溫度：450 ℃；脫溶劑氣流速：900 L·h-1；多反應監測（MRM）離子掃描模式。

2.2 溶液的制備

2.2.1何首烏提取物的制備 取何首烏藥材5 kg，用10 倍量70%乙醇加熱回流提取2 次，提取時間分別為2.0、1.5 h，合并提取液，并濃縮、干燥，得PWE 粉末，得率為20%。取何首烏藥材5 kg，用10倍量蒸餾水加熱回流提取2 次，提取時間分別為2.0、1.5 h，合并提取液，并濃縮、干燥得PMW 粉末，得率為25%。精密稱取PMW 和PWE 適量，加0.5%的CMC-Na溶液混懸并定容，制成質量濃度為0.6 g·mL-1的PME 混懸液和0.75 g·mL-1的PMW 混懸液（相當何首烏生藥質量濃度3 g·mL-1），置于4 ℃，備用。

2.2.2對照品溶液的配制 分別精密稱取大黃素、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、二苯乙烯苷和1,8-二羥基蒽醌（內標）對照品適量于10 mL量瓶，加甲醇溶解并定容，制成質量濃度為0.10 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.3 大鼠組織供試品的制備

將SD 大鼠隨機分為PMW 給藥組、PME 給藥組和對照組，每組各10 只。分別給予PMW（劑量：15 g·kg-1、20 mL·kg-1，相當于60 g·kg-1生藥量）、PME（劑量：12 g·kg-1、20 mL·kg-1，相當于60 g·kg-1生藥量）和同體積0.5%的CMC-Na溶液，連續給藥42 d。末次給藥后立即腹腔注射25%的烏拉坦0.5 mL麻醉，通過膽管插管接取膽汁1 h，置于離心管中，存于-20℃，待測。然后由腹主動脈取血，置于肝素化的試管中，15 000 r·min-1離心10 min（離心半徑為10 cm），取上清血漿存于-20 ℃，待測。并脫頸處死大鼠，取肝臟、腎臟，用濾紙吸干表面水分，稱質量。

2.3.1血漿和膽汁供試品的制備 分別取大鼠血漿和膽汁樣品100 μL，加入內標溶液40 μL，再加入4倍量甲醇，渦旋振蕩1 min，混勻，以15 000 r·min-1離心10 min（離心半徑為10 cm），取出全部上清液，氮氣吹干。殘渣分別用甲醇400 μL，超聲（250 W，50 kHz）復溶，以15 000 r·min-1離心15 min（離心半徑為10 cm），取上清液經0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液用于分析。

2.3.2肝臟和腎臟供試品的制備 分別取大鼠的肝臟和腎臟樣品各0.5 g，剪碎，加入約2倍量0.9%氯化鈉勻漿，以15 000 r·min-1離心10 min（離心半徑為10 cm），取出上清勻漿液400 μL。加入內標溶液40 μL，再加入4 倍量甲醇，渦旋振蕩1 min，混勻，以15 000 r·min-1離心10 min（離心半徑為10 cm），取上清液，氮氣吹干。殘渣分別用甲醇400 μL，超聲（250 W，50 kHz）復溶，以15 000 r·min-1離心15 min（離心半徑為10 cm），取上清液經0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液即得。

2.4 方法學考察

2.4.1專屬性試驗 按2.3 項下方法分別制備對照組及給藥組供試品（肝、腎、血漿和膽汁），采用2.1 項下色譜質譜條件進行分析測定，混合對照品溶液直接進樣分析。

2.4.2標準曲線制備 混合對照品溶液用甲醇稀釋至不同質量濃度，氮氣吹干后用1 mL 不同組織樣品復溶，制備不同質量濃度的對照品組織樣品溶液，按2.1 項下色譜質譜條件通過高效液相色譜串聯質譜法（UPLC-MS/MS）分析測定，以對照品質量濃度為橫坐標（X），對照品與內標的峰面積比值為縱坐標（Y），用加權最小二乘法進行線性回歸運算，分別建立對照品的線性回歸方程。

2.4.3精密度試驗 取混合對照品溶液用甲醇稀釋成低、中、高3 個質量濃度，氮氣吹干后，再用肝臟組織樣品復溶，采用2.1 項下色譜質譜條件進行分析測定。同天內對各質量濃度的肝臟樣品（每個質量濃度5 批）進行測定，連續測定3 d，計算批間RSD。對照組腎臟、血漿和膽汁樣品同上操作。

2.4.4加樣回收率試驗 取組織樣品（肝臟、腎臟、膽汁和血漿）3 份，分別加入高、中、低質量濃度的混合對照品溶液，配置成含對照品組織樣品，按2.3項下處理條件處理后，采用2.1項下色譜質譜方法分析測定，記錄色譜峰面積，每個質量濃度平行操作5次。根據上述2.4.2項下標準曲線分別計算待測物質量濃度，并以加入量之比計算加樣回收率。

2.4.5穩定性試驗 精密吸取混合對照品溶液，用甲醇稀釋成低、中、高3 個質量濃度（每個質量濃度5 份），分別加入離心管中，氮氣吹干后分別用組織樣品（肝、腎、膽汁、血漿）復溶，按照2.3 項下的方法處理，分別考察室溫下穩定性，凍融穩定性和長期凍存穩定性。具體方法：1）室溫（25 ℃）放置24 h后進樣，考察室溫下放置穩定性；2）置于-20 ℃冰箱中冷凍，取出室溫下解凍，反復凍融3次，最后一次室溫解凍后進樣，考察凍融穩定性；3）放置-20 ℃冰箱冷凍30 d，室溫解凍后進樣，考察長期凍存穩定性。

3 結果

3.1 方法學考察結果

3.1.1專屬性 對照品質譜信息見表1。按2.1 項下色譜質譜條件測定，大黃素、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、二苯乙烯苷和1,8-二羥基蒽醌的峰形良好、分離完全、無雜質峰干擾，說明對照組樣品對測定無干擾，專屬性強，見圖1。

圖1 大鼠各組織樣品的總離子流圖

表1 對照品和內標的MRM參數、錐孔電壓和碰撞能量

3.1.2標準曲線制備 3個成分在一定的質量濃度范圍內線性良好，信噪比（S/N）=10為定量限（表2）。

表2 大鼠組織中二苯乙烯、大黃素及大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷的回歸方程、線性范圍和定量限

3.1.3精密度試驗 3 個質量濃度的大黃素、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷及二苯乙烯苷，在各個含藥組織中日內、日間精密度RSD 均小于15%，符合試驗要求。

3.1.4加樣回收率試驗 3 個質量濃度的大黃素、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷及二苯乙烯苷，在各個含藥組織中的回收率見表3，均符合試驗要求。

表3 大鼠組織中二苯乙烯、大黃素及大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷的加樣回收率

3.1.5穩定性試驗 大黃素、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、二苯乙烯苷的室溫穩定性、凍融穩定性和長期凍存穩定性試驗的RSD均小于15%，說明穩定性良好。

3.2 PME和PMW在大鼠體內分布比較

經過42 d 灌胃PME 和PMW 后，大黃素、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷和二苯乙烯苷在大鼠肝、腎、血漿和膽汁中的含量見表4。

表4 大鼠組織中大黃素、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷和二苯乙烯苷的質量分數（,n=10）

表4 大鼠組織中大黃素、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷和二苯乙烯苷的質量分數（,n=10）

注：與PME組各成分含量相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

分析PMW 與PME 組給藥后，化學成分在大鼠體內不同組織的分布情況見圖2。兩給藥組中3個主要成分選擇性蓄積的靶器官基本相同。二苯乙烯苷主要蓄積在肝臟中，大黃素主要蓄積在腎臟中，大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷主要蓄積在膽汁中，而血漿中3 個成分的含量均較低。進一步分析化學成分在各個組織中的蓄積差異見圖3，肝臟、腎臟中二苯乙烯苷蓄積量PME組遠高于PMW 組，大黃素次之，大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷差異較小。血漿和膽汁中蓄積成分以二苯乙烯苷和大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷為主，同樣為PME組高于PMW 組。以上結果提示，大鼠口服PME 與PMW 后，PME 組大鼠體內成分蓄積更顯著。

圖2 PME和PMW組給藥后化學成分在大鼠各組織中分布對比

圖3 PME和PMW組給藥后3個成分在大鼠不同組織中的蓄積對比

4 討論

本研究首先建立了大鼠體內肝、腎、血漿、膽汁組織中二苯乙烯苷、大黃素及大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷的定量測定方法。此外，在連續灌胃42 d PME和PMW后，對3個成分在不同組織中的含量進行了定量分析，考察其在大鼠體內的蓄積狀況，以期通過蓄積成分發現何首烏引發不良反應的原因。

本研究對何首烏藥材分別采用不同提取工藝制備成PME 和PMW 后給予大鼠，結果發現PME 給藥組大鼠體內不同組織中相同成分蓄積量明顯高于PMW組。此外，2個給藥組3個成分均存在明顯的組織選擇性，且趨勢相同。二苯乙烯苷主要蓄積在肝臟中，大黃素主要蓄積在腎臟中，大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷主要蓄積在膽汁中，而血漿中3個成分的含量均較低，提示不同類成分對組織有明顯的選擇性蓄積。有研究表明PME 的肝毒性高于PMW，推測這可能與PME 給藥后體內蓄積成分含量高相關[8-10]。研究中還發現，無論是PME還是PMW給藥組，二苯乙烯苷均大量蓄積于大鼠肝臟中，以往文獻表明，該成分直接毒性作用較小[2-4]，因此該成分是否通過藥物相互作用等其他作用機制產生毒性值得進一步研究。由于何首烏引發肝損傷的主要表現為膽汁淤積，而大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷主要蓄積在膽汁中，因此推測其為潛在毒性成分。此外，有文獻表明，何首烏中的蒽醌類成分為其主要肝毒性成分[11-14]，但筆者發現大黃素主要蓄積部位為腎臟，因此其與肝毒性是否直接相關也值得探討。