礦物藥青礞石對戊四氮點(diǎn)燃癲癇大鼠血清中IL-1β和IL-2等細(xì)胞因子水平的影響△

袁鵬，馬瑜璐，劉圣金*，房方，楊文國，卞勇，徐晨昱，王迎，吳思澄，張志杰，奧·烏力吉

1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院/江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心/中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心/國家中醫(yī)藥管理局中藥資源循環(huán)利用重點(diǎn)研究室，江蘇 南京 210023；

2.中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所，北京 100700；

3.內(nèi)蒙古民族大學(xué)，內(nèi)蒙古 通遼 028000

癲癇（epilepsy，EP）是一種以反復(fù)性、持久性、具有致癇傾向?yàn)樘卣鞯穆阅X部疾病，是由腦部神經(jīng)元過度放電引起的功能障礙疾病[1]。早期針對癲癇發(fā)病的機(jī)制研究主要集中在氧化應(yīng)激、神經(jīng)遞質(zhì)水平改變、細(xì)胞凋亡等。近年來，越來越多研究證實(shí)炎癥反應(yīng)與癲癇的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]。炎癥因子能夠影響神經(jīng)遞質(zhì)的合成釋放、神經(jīng)元間電傳遞等，異常升高的炎癥因子能夠破壞海馬結(jié)構(gòu)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、破壞血腦屏障完整性[3]，此外還能觸發(fā)自由基的形成和誘導(dǎo)谷氨酰胺神經(jīng)傳遞的改變，導(dǎo)致神經(jīng)元興奮性的增加，引起神經(jīng)元異常放電，從而促進(jìn)癲癇的發(fā)生或加劇癲癇癥狀[4]。長期的炎癥因子失衡還可能造成持續(xù)性的神經(jīng)損傷，不利于大腦功能的正常發(fā)揮，從而導(dǎo)致多種神經(jīng)疾病的發(fā)生發(fā)展。本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)，青礞石混懸液能夠顯著降低大鼠海馬區(qū)病變程度，且檢測到腦組織皮層與海馬中興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸、天冬氨酸含量顯著降低，青礞石對于癲癇有較好的治療效果[5-6]。本研究在前期藥效學(xué)研究的基礎(chǔ)上，利用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）研究礦物藥青礞石（Chloriti Lapis）對戊四氮（PTZ）點(diǎn)燃慢性癲癇大鼠血清中炎癥細(xì)胞因子表達(dá)水平的干預(yù)情況，探討青礞石可能通過影響免疫反應(yīng)參與治療慢性癲癇的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級雄性SD 大鼠55 只，體質(zhì)量180～220 g，購于浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SCXK（浙）2019-0002。大鼠于適宜條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由飲食飲水，飼養(yǎng)于屏障環(huán)境中，12 h晝夜交替，室溫20～24 ℃，相對濕度50%左右。動物實(shí)驗(yàn)通過南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)文號為20190A029。

1.2 試藥

青礞石藥材由亳州礦石專營店提供（批號：20140412），經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定學(xué)教研室吳德康教授鑒定為中藥材青礞石（Chloriti Lapis），經(jīng)南京大學(xué)地球科學(xué)與工程學(xué)院孔慶友教授鑒定為變質(zhì)巖類黑云母片巖（Biotite Schist），樣品留存于南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定學(xué)教研室；卡馬西平片（批號：X1395，北京諾華制藥有限公司）；PTZ（批號：1002905179，美國Sigma 公司）；白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-6 ELISA 試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司）；IL-2、超敏C 反應(yīng)蛋白（hs-CRP）、γ-干擾素（IFN-γ）、高遷移率族蛋白B-1（HMGB-1）ELISA 試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；聚乙二醇400（PEG 400，化學(xué)純，批號：20170515，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 儀器

Infinite M200 PRO NANOQUANT型酶標(biāo)儀（瑞士Tecan 公司）；TDL-240B 型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

2 方法

2.1 模型制備

采用PTZ點(diǎn)燃法制備癲癇大鼠模型[5-7]，用0.9%氯化鈉溶液將PTZ配成質(zhì)量濃度為0.01 g·mL-1的溶液，每日固定時間以腹腔注射方式（35 mg·kg-1）造模。持續(xù)給藥4周后，停1周，再以同劑量PTZ給藥，參照Racine 分級標(biāo)準(zhǔn)，包括有無驚厥、面部陣攣、節(jié)律性點(diǎn)頭、前肢陣攣及跌倒等特征，以大鼠連續(xù)表現(xiàn)5 次Ⅱ級或Ⅱ級以上驚厥反應(yīng)為達(dá)到點(diǎn)燃標(biāo)準(zhǔn)。Ⅰ級標(biāo)準(zhǔn)：面部陣攣；Ⅱ級標(biāo)準(zhǔn)：面部陣攣并伴節(jié)律性點(diǎn)頭；Ⅲ級標(biāo)準(zhǔn)：面部陣攣、伴節(jié)律性點(diǎn)頭及前肢陣攣；Ⅳ級標(biāo)準(zhǔn)：面部陣攣、伴節(jié)律性點(diǎn)頭、前肢陣攣及后肢站立；Ⅴ級標(biāo)準(zhǔn)：面部陣攣、伴節(jié)律性點(diǎn)頭、前肢陣攣、后肢站立并跌倒。大鼠若出現(xiàn)持續(xù)Ⅴ級無明顯間歇的癲癇發(fā)作狀態(tài)，給予7%的水合氯醛1 mL緩解發(fā)作。

2.2 樣品的制備

卡馬西平片溶于0.9%氯化鈉溶液，配制成質(zhì)量濃度為0.02 g·mL-1的卡馬西平溶液。青礞石藥材去除石英等雜質(zhì)，置瑪瑙研缽中研磨成細(xì)粉，過六號篩，用PEG400為介質(zhì)配成含青礞石細(xì)粉0.5 g·mL-1的混懸液，每次給藥前超聲混勻。

2.3 分組與給藥

實(shí)驗(yàn)動物共分為5 組。0.9%氯化鈉溶液處理的大鼠作為對照組，10 只；造模成功的大鼠共32 只，隨機(jī)均分為4組，每組8只，分別為模型組、陽性對照卡馬西平組、青礞石高劑量組、青礞石低劑量組。對照組和模型組大鼠給予5 mL·kg-10.9%氯化鈉溶液灌胃；卡馬西平組大鼠按100 mg·kg-1（5 mL·kg-1）劑量灌胃給藥；按青礞石臨床用量的20、5 倍（臨床等效劑量）設(shè)計給藥高、低劑量，分別為2000、500 mg·kg-1（4、1 mL·kg-1），灌胃給藥。每天固定時間給藥1 次，持續(xù)給藥4 周。每周稱量體質(zhì)量2 次，并根據(jù)體質(zhì)量變化調(diào)整劑量。

2.4 血清中細(xì)胞因子檢測

末次給藥后次日，異氟烷吸入麻醉后處死各組大鼠，腹主動脈取血5 mL，室溫放置1 h，3000 r·min-1離心15 min（離心半徑16 cm）取上清，分裝待測。采用ELISA 試劑盒測定血清中IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ、HMGB-1、hs-CRP 水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

2.5 數(shù)據(jù)處理及分析

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般情況

各組大鼠體質(zhì)量隨時間增加，增速相似，無明顯差異。大鼠造模1周左右毛色逐漸發(fā)黃，第2周開始出現(xiàn)Ⅱ級驚厥反應(yīng)，造模第4 周，大鼠出現(xiàn)Ⅱ級及以上驚厥反應(yīng)；造模測試中，大鼠多出現(xiàn)連續(xù)5次Ⅱ級或Ⅱ級以上驚厥反應(yīng)，達(dá)到PTZ 點(diǎn)燃癲癇大鼠模型標(biāo)準(zhǔn)，造模成功率70.0%以上。

3.2 血清中IL-1β、IL-2等細(xì)胞因子表達(dá)水平

各組間不同細(xì)胞因子表達(dá)水平見表1。單因素方差分析結(jié)果可知，IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ、HMGB-1、hs-CRP表達(dá)水平在各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。

表1 各組大鼠血清中炎癥因子表達(dá)水平（）

表1 各組大鼠血清中炎癥因子表達(dá)水平（）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與卡馬西組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

進(jìn)一步進(jìn)行事后多重比較分析（Post-hoc test），見表1。與對照組比較，模型組大鼠血清中IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α、hs-CRP 含量均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，給予卡馬西平和高、低劑量青礞石混懸液后，大鼠血清中IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ、HMGB-1、hs-CRP 水平呈顯著降低趨勢，除卡馬西平組IL-2、IFN-γ、HMGB-1 外，其他組各細(xì)胞因子差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。與卡馬西平組比較，青礞石高、低劑量組大鼠血清中HMGB-1 水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；青礞石低劑量組大鼠血清中TNF-α水平顯著升高（P＜0.05），IFN-γ水平顯著降低（P＜0.05）。3 個給藥處理組間IL-1β、IL-2、IL-6、hs-CRP 水平變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

3.3 細(xì)胞因子間相關(guān)性分析

細(xì)胞因子IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ、HMGB-1、hs-CRP 之間相關(guān)性分析見表2，可以看見各細(xì)胞因子之間呈正相關(guān)，IL-1β與IL-2、IL-6、TNF-α、hs-CRP呈顯著正相關(guān)（P＜0.05，P＜0.01），IL-2與IL-6呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），IL-6與TNF-α、hs-CRP 呈顯著正相關(guān)（P＜0.05，P＜0.01），TNF-α與hs-CRP呈顯著正相關(guān)（P＜0.01），IFN-γ與HMGB-1呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。

表2 血清中細(xì)胞因子相關(guān)性分析

3.4 炎癥細(xì)胞因子與結(jié)腸中特定腸道菌群相關(guān)性分析

本課題組前期對青礞石干預(yù)PTZ 點(diǎn)燃癲癇大鼠結(jié)腸腸道微生物進(jìn)行研究[8]，發(fā)現(xiàn)各組大鼠的優(yōu)勢菌群主要有厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria），其中厚壁菌門占比最大，其次是擬桿菌門。青礞石干預(yù)后疣微菌門、變形菌門、Akkermansia菌屬豐度下降，乳桿菌屬（Lactobacillus）的相對豐度升高。結(jié)果表明，青礞石對PTZ 點(diǎn)燃癲癇大鼠腸道菌群物種組成的豐富度具有明顯的調(diào)節(jié)作用，可有效干預(yù)腸道微生態(tài)的重建。結(jié)合該研究，將血清中炎癥等細(xì)胞因子IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ、HMGB-1、hs-CRP 含量與大鼠結(jié)腸中特定菌群厚壁菌門、擬桿菌門、疣微菌門、變形菌門、乳桿菌屬、Akkermansia菌屬豐度間進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見表3。其中疣微菌門豐度與炎癥因子IL-6、TNF-α、hs-CRP 含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；Akkermansia菌屬豐度與IL-6、TNF-α、hs-CRP 含量也呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。進(jìn)一步證實(shí)了青礞石通過干預(yù)細(xì)胞因子（IL-6、TNF-α、hs-CRP）、Akkermansia菌屬對PTZ點(diǎn)燃癲癇大鼠產(chǎn)生治療作用。

表3 血清中各細(xì)胞因子含量與結(jié)腸中特定菌群豐度相關(guān)性分析

4 討論

健康狀態(tài)下的炎癥反應(yīng)能激活神經(jīng)保護(hù)及修復(fù)其所需的激活通路，但當(dāng)炎癥因子過度表達(dá)時，會對神經(jīng)系統(tǒng)造成嚴(yán)重且持續(xù)的損傷，引發(fā)包括癲癇在內(nèi)的多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病[9]。大量研究證明，炎癥反應(yīng)參與癲癇的發(fā)生發(fā)展，炎癥因子能夠破壞海馬結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)癲癇的發(fā)生[4]。Zhou 等[10]利用天麻素聯(lián)合葉酸、維生素B12治療腦卒中后癲癇患者，檢測其治療前后血清中HMGB-1、IL-2、IL-6 水平。結(jié)果顯示聯(lián)合用藥治療后，患者血清中HMGB-1、IL-2、IL-6 水平顯著下降，其中與癲癇關(guān)系密切的IL-6 減少趨勢最明顯，表明癲癇會引起相關(guān)炎癥反應(yīng)，天麻素聯(lián)合用藥能一定程度上通過抑制炎癥反應(yīng)來緩解癲癇發(fā)生發(fā)展。江衛(wèi)[11]給予PTZ 點(diǎn)燃癲癇大鼠腹腔注射生理濃度內(nèi)的硫氫化鈉溶液，利用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）和蛋白印跡法（Western blotting）檢測大鼠海馬組織中TNF-α、IL-1β、IL-6 及核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）/p65 的mRNA和蛋白相對表達(dá)量，結(jié)果顯示TNF-α、IL-1β、IL-6和NF-κB/p65 的mRNA 和蛋白相對表達(dá)量顯著降低，表明適度增加硫化氫濃度可以通過抑制NF-κB信號通路的激活來降低炎癥反應(yīng)，發(fā)揮治療癲癇的作用。

本實(shí)驗(yàn)中，PTZ 點(diǎn)燃的癲癇模型大鼠血清中各炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ、HMGB-1、hs-CRP 表達(dá)水平顯著升高，在給予陽性藥卡馬西平和不同劑量青礞石后，這些因子水平顯著降低，其中青礞石高劑量效果一定程度上優(yōu)于低劑量。表明礦物藥青礞石可能影響癲癇發(fā)生時的炎癥反應(yīng)，通過免疫途徑作用于大腦，緩解癲癇的發(fā)生發(fā)展。

在癲癇相關(guān)的炎癥反應(yīng)中，發(fā)揮主要作用的是各類細(xì)胞因子，如IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ、HMGB-1、hs-CRP 等[12]。IL-1β是IL-1 家族中的一員，IL-1 家族成員是先天免疫和炎癥的中樞介質(zhì)，具有多種局部和全身效應(yīng)的多效細(xì)胞因子，在多發(fā)性炎癥疾病中起關(guān)鍵作用[13]。IL-1β是一類促炎因子，其異常高表達(dá)表明機(jī)體發(fā)生了嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，持續(xù)過度表達(dá)的IL-1β會造成更嚴(yán)重的神經(jīng)損傷。此外，Roseti 等[14]發(fā)現(xiàn)高濃度的IL-1β顯著降低了顳葉癲癇患者海馬和皮質(zhì)中的γ-氨基丁酸（GABA）電流振幅，通過減少GABA 介導(dǎo)的神經(jīng)傳導(dǎo)促進(jìn)癲癇發(fā)作。IL-6 主要由膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，在炎性反應(yīng)中具有雙向調(diào)節(jié)性。研究表明，低劑量的IL-6 能夠有效保護(hù)神經(jīng)免受損傷，但當(dāng)IL-6 長期過度暴露后會引起膠質(zhì)細(xì)胞增生，產(chǎn)生神經(jīng)毒性反而加重癲癇的發(fā)生[15]。TNF-α同IL-6 一樣針對炎性反應(yīng)具有雙向調(diào)節(jié)作用，正常生理狀態(tài)下，TNF-α參與保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，當(dāng)其含量劇烈升高時，通過TNF受體1（TNFR1）受體通路產(chǎn)生神經(jīng)毒性，促進(jìn)癲癇發(fā)生[16]。此外，癲癇發(fā)作會破壞血腦屏障完整性，從而使TNF-α入侵大腦，損傷神經(jīng)系統(tǒng)，加劇癲癇的發(fā)生發(fā)展[16]。研究顯示，IL-2 可以通過調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞平衡來達(dá)到縮短癲癇潛伏期的作用，從而影響癲癇的發(fā)作[17]。HMGB-1 是腦內(nèi)重要的促炎因子，在與癲癇相關(guān)的炎癥反應(yīng)中處于關(guān)鍵位置。HMGB-1 本身會在神經(jīng)元受損后調(diào)節(jié)IL-2、IL-6、IFN-γ等炎癥因子的釋放，此外，HMGB-1 還能與腦缺血后晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）結(jié)合激活NF-κB 信號通路，調(diào)節(jié)IL-1β、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）的釋放；與TLR4 結(jié)合激活星形膠質(zhì)細(xì)胞；與IL-1β結(jié)合形成復(fù)合物加劇炎癥反應(yīng)。HMGB-1 通過上述多種方式誘發(fā)炎癥反應(yīng)，參與癲癇的發(fā)生發(fā)展過程[18]。hs-CRP 是由于炎癥反應(yīng)刺激產(chǎn)生的急性蛋白，在臨床中也常用作檢測炎癥發(fā)生的標(biāo)志物。張敏等[19]通過檢測115 例癲癇患者腦電圖放電情況和血hs-CRP 含量，發(fā)現(xiàn)具癲癇樣放電患者體內(nèi)hs-CRP 含量更高，說明癲癇發(fā)生可能與炎癥的發(fā)生具有相關(guān)性，為hs-CRP 臨床用于驗(yàn)證癲癇發(fā)作后腦損傷程度提供了一定依據(jù)。研究顯示，這些炎癥相關(guān)細(xì)胞因子常協(xié)同參與癲癇發(fā)生發(fā)展過程。HMGB-1 與IL-2、IL-6 表達(dá)水平呈正相關(guān)，HMGB-1 的釋放促進(jìn)分泌IL-2、IL-6，IL-2、IL-6 的增加又會促進(jìn)釋放HMGB-1[20]；TNF-α也能促進(jìn)IL-2、IL-6 等炎癥因子的釋放，這些炎癥因子的級聯(lián)作用會加劇炎癥反應(yīng)，提高神經(jīng)元興奮性，誘導(dǎo)并且加重癲癇發(fā)生[21]。本實(shí)驗(yàn)中對于炎癥等細(xì)胞因子IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ、HMGB-1、hs-CRP 間進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果顯示各因子間呈正相關(guān)，也反映了各因子間可相互協(xié)同，促進(jìn)癲癇的發(fā)生發(fā)展。

“腦-腸軸”學(xué)說提出，腸道菌群與中樞神經(jīng)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)雙向交流的其中一條途徑是免疫途徑[22]。腸道菌群在生命初期就會刺激先天免疫，塑造初期免疫系統(tǒng)，促進(jìn)相關(guān)淋巴系統(tǒng)的成熟[23]。無菌小鼠表現(xiàn)為先天免疫系統(tǒng)缺失，易于觸發(fā)焦慮、抑郁等神經(jīng)精神疾病，當(dāng)接收來自健康小鼠的糞便移植后，這些癥狀會得到一定程度的緩解[24]。腸道菌群能夠活化T 細(xì)胞分化造成局部炎癥反應(yīng)或識別自身抗原，抑制調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg）表達(dá)，從而影響外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)[25]。Toll樣受體（TLR）會與腸道菌群表面相關(guān)受體結(jié)合，血腦屏障受損后TLR4 能夠穿過血腦屏障進(jìn)入大腦引起炎癥反應(yīng)[26]。腸道菌群及其代謝物質(zhì)如脂多糖、短鏈脂肪酸也會參與免疫反應(yīng)的發(fā)生，促進(jìn)促炎因子的產(chǎn)生，或直接刺激迷走神經(jīng)，或通過血腦屏障直接影響大腦[27]。Dou等[28]給予膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠口服姜黃素2周，結(jié)果可見CIA 大鼠腸道、大腦內(nèi)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶和乙酰膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)顯著增加，迷走神經(jīng)元興奮性顯著提高，但切斷迷走神經(jīng)后姜黃素的恢復(fù)作用消失，表明姜黃素具有調(diào)節(jié)膽堿能系統(tǒng)的功能，通過“腦-腸軸”減弱CIA 發(fā)生。本研究中，結(jié)腸中特定菌群與炎癥因子相關(guān)性結(jié)果顯示腸道菌群與細(xì)胞因子間存在一定相關(guān)性，表明一些特定腸道菌群可能通過影響炎癥因子表達(dá)水平，參與炎癥反應(yīng)的發(fā)生，從而實(shí)現(xiàn)對癲癇發(fā)生發(fā)展的干預(yù)。

雖然大量研究均顯示癲癇的發(fā)生與炎癥反應(yīng)有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)中對于治療癲癇有明確作用的青礞石也能顯著降低炎癥因子表達(dá)水平，但關(guān)于癲癇與炎癥免疫之間的具體作用機(jī)制仍需要更深入的研究。本研究為從減輕炎癥反應(yīng)緩解癲癇發(fā)生發(fā)展角度治療癲癇提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。