沒食子質量標準研究△

塔布斯·馬那爾，蘇來曼·哈力克

新疆維吾爾自治區藥品檢驗研究院/國家藥品監督管理局中藥（維藥）質量控制重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830054

沒食子（Infectoriae Galla）為殼斗科植物沒食子樹Quercus infectoriaG.Oliver 幼枝上形成的干燥蟲癭，由沒食子蜂科昆蟲沒食子蜂Cynips gallaetinctoriaeOliv.幼蟲寄生而成，分布于希臘、土耳其、敘利亞、伊朗及印度等地，我國無分布記載。本品為維吾爾族醫常用的進口藥材，維吾爾族語稱“moza”，漢語音譯即“沒扎”，收載于《中國醫學百科全書·維吾爾醫學卷》[1]和《中華本草·維吾爾藥卷》[2]。沒食子性質二級寒、三級干，具生干生寒、燥濕收斂、固牙止痛、清熱消炎、祛腐愈傷、涼血止血、止瀉止痢等作用，臨床用于牙齦腫痛、牙齒松動、咽喉腫痛、瘡瘍腐爛、傷口不愈、濕性白帶過多、子宮出血、瀉痢不止等濕熱性或血液性疾病。中醫認為其具有澀腸、固精、止咳、止血、斂瘡之功效；主治久瀉久痢、遺精、盜汗、咳嗽、咯血、便血、痔血、創傷出血、瘡瘍久不收口、口瘡、齒痛。

沒食子中含鞣質（50%～70%）、沒食子酸（2%～4%）、并沒食子酸及樹脂等成分[3]。劉延麟[4]報道沒食子含沒食子酸、間-二沒食子酸、對-二沒食子酸、沒食子酸甲酯、沒食子酸乙酯、1,2,3,6-四-O-沒食子酰基-β-D-葡萄糖、1,2,3,4,6-五-O-沒食子酰基-β-D-葡萄糖、1-O-沒食子酰基-O-β-D-葡萄糖、1,6-二-O-沒食子酰基-O-β-D-葡萄糖。龍飛[5]報道沒食子還含異丙隆、6-甲基-十八烷、鄰苯二甲酸丁酯、3-戊基-環氧乙烷-2-庚酸-甲酯、異膽酸乙酯、8-(1,2-二溴-2-苯基乙基)-3,7-二氫-1,3,7-三甲基-1-唑嘌呤-2,6-二酮、17-烯-35 烷、(Z)-9-油酸-3-烷氧基-丙酯。現代研究表明，沒食子具有抑菌、殺菌、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、抗輻射等藥理活性，具有較大的開發和應用價值[6-10]。沒食子還是《中華人民共和國衛生部藥品標準·維吾爾藥分冊》[11]收載的西帕依固齦液等10 種成方制劑處方的主要藥味，現行標準《維吾爾藥材標準》（上冊）僅收載性狀和試管鑒別項[3]。為了更好地控制沒食子質量，本研究系統分析了進口沒食子樣品性狀、顯微特征，對其進行薄層色譜鑒別及水分、總灰分、浸出物、重金屬及有害元素、農藥殘留和沒食子酸含量測定，建立了比較完善的質量控制和評價標準。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AT 型高效液相色譜儀，包括SPD-M10A型二極管陣列檢測器、SIL-20A 型自動進樣器、CTO-10AS型柱溫箱、LC So1ution型色譜工作站（日本島津公司）；TC-C18型色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美國Agilent 公司）；AE200 型萬分之一電子分析天平（瑞士梅特勒-托雷多公司）；CPA225 D 型萬分之一電子分析天平（德國賽多利斯公司）；KLZ-UP 型超純水儀（臺灣艾柯成都康寧實驗專用純水設備廠）；REPROSTAR3 型薄層色譜成像系統（瑞士CAMAG 公司）；BX-51 型生物顯微照相系統（日本奧林巴斯公司）；SK7210LHC 型超聲儀（上海科導超聲儀器有限公司，功率250 W，頻率50 kHz）；QJGW-2 型箱式電阻爐（北京煤化所煤質儀器研制中心）；GZX-9140MBE 型數顯鼓風干燥箱（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）；XT-1000A 型高速多功能粉碎機（浙江永康市太陽機電有限公司）。

1.2 試藥

對照品沒食子酸（批號：110831-201204，純度≥98%，中國食品藥品檢定研究院）；沒食子酸甲酯（批號：AB152M，純度≥98%，天津一方科技有限公司）；沒食子對照藥材（批號：20140304，新疆維吾爾自治區藥品檢驗研究院）；聚酰胺薄膜（15 cm×15 cm，英國Chemicals Ltd Poole England 公司）；乙腈為色譜純（美國Fisher 公司）；水為超純水；其他試劑均為分析純。

沒食子藥材樣品11 批，經新疆維吾爾自治區藥品檢驗研究院蘇來曼·哈力克主任藥師鑒定為正品沒食子，來源信息見表1，其中樣品7～9從巴基斯坦進口。

表1 沒食子樣品信息

2 方法與結果

2.1 性狀

本品呈類球形，直徑1.0～2.5 cm，偶見短柄。外表面黃白色、黃棕色、黃綠色或墨綠色，具不規則點狀或波狀突起，底端具喙狀凸起的柄殘基。表面色淺者腰部多具1 個直徑2～4 mm 的圓形孔道，偶見2～3 個或更多（圖1）。橫切面中央多有圓形空隙，殘留幼蜂尸體或蛹蛻殼。質硬而脆，斷面不平坦，邊緣黃白色至黃棕色，中央棕色至棕褐色。氣微，味澀、極苦。

圖1 沒食子樣品外觀

2.2 鑒別

2.2.1顯微鑒別 沒食子橫切面：取供試品，水浸軟化后徒手制橫切片，加甘油乙酸試液透化，置解剖鏡下觀察。外表皮層由2～3 層橢圓形厚壁細胞組成，內含棕色塊；皮層為橢圓形或圓形細胞，壁稍厚；中間層具外韌型維管束，略木質化；中央為多角形或不規則薄壁細胞（圖2）。

圖2 沒食子橫切面顯微組織特征（×100）

沒食子粉末：呈黃白色。石細胞橢圓形、類長方形或不規則，壁厚，胞腔小，長60～280 μm，寬20～90 μm；網紋細胞長橢圓形或卵形，胞腔大，具圓形紋孔；淀粉粒單粒或復粒，圓形或橢圓形，臍點呈十字形或人字形，直徑15～30 μm。草酸鈣簇晶直徑20～40 μm；導管為螺紋；棕色樹脂分泌物圓形、長方形，直徑10～20 μm（圖3）。

圖3 沒食子粉末顯微組織特征

2.2.2薄層色譜鑒別 取本品粉末（過三號篩）0.1 g，置具塞試管加甲醇5 mL，超聲（功率250 W，頻率50 kHz）處理15 min，靜置，上清液作為供試品溶液。取對照品沒食子酸和沒食子酸甲酯，加甲醇制成0.5 mg·mL-1溶液，作為對照品溶液。另取沒食子對照藥材0.1 g，同供試品方法制成對照藥材溶液。采用薄層色譜法[《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版（四部）通則0502]，吸取上述4 種溶液各1 μL，分別條狀點于同一聚酰胺薄膜上，以50%乙醇為展開劑，展開，取出，揮干，噴以1%三氯化鐵乙醇溶液，供試品色譜中在與對照品色譜相應的位置上顯相同顏色的斑點。見圖4。

圖4 沒食子樣品薄膜色譜圖

2.3 水分測定

分別取11 批供試品適量，按照《中國藥典》2020 年版（四部）通則0832 第二法測定水分。結果顯示，沒食子樣品水分為8.5%～9.7%，平均值為9.1%，暫定水分應不得超過12.0%。

2.4 總灰分測定

分別取11 批供試品適量，按《中國藥典》2020年版（四部）通則2302 規定測定總灰分。結果顯示，沒食子樣品總灰分為1.2%～1.5%，平均值為1.3%，暫定總灰分應不得超過2.0%。

2.5 酸不溶性灰分測定

分別取11 批供試品適量，按《中國藥典》2020年版（四部）通則2302 規定測定酸不溶性灰分。結果顯示，沒食子樣品酸不溶性灰分為0.02%～0.11%，平均值為0.07%，暫不列入標準。

2.6 重金屬及有害元素測定

11 批沒食子樣品送新疆維吾爾自治區產品質量技術監督研究院，按《中國藥典》2020 年版四部（通則）2321 鉛、鎘、砷、汞、銅測定法測定重金屬及有害元素。結果顯示，重金屬及有害元素含量較低或未檢出，均符合規定，因此未列入標準。

2.7 農藥殘留測定

按《中國藥典》2020 年版四部（通則）2341 農藥殘留量測定法，11 批沒食子樣品中有機氯農藥（六六六、滴滴涕、林丹、七氯、艾氏劑、三氯殺螨醇）殘留、菊酯類農藥（氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯）殘留均未檢出。

2.8 浸出物測定

分別取11 批供試品適量，按《中國藥典》2020年版（四部）通則2201 熱浸法測定，70%乙醇為溶劑。結果顯示，浸出物質量分數為84.8%～91.0%，平均值為88.8%，暫定浸出物應不得少于80.0%。

2.9 沒食子酸含量測定

2.9.1色譜條件 Agilent TC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為0.5%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～15 min，97%A；15～30 min，97%～80%A；30～31 min，80%～97%A；31～40 min，97%A）；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為35 ℃；檢測波長為273 nm；理論板數按沒食子酸峰計算，應不低于6000。高效液相色譜（HPLC）圖見圖5。

圖5 沒食子中沒食子酸HPLC圖

2.9.2對照品溶液的制備 取沒食子酸對照品適量，精密稱定，置于棕色量瓶中，加甲醇制成40 μg·mL-1的溶液，即得。

2.9.3供試品溶液的制備 精密稱取沒食子樣品粉末（過三號篩）0.1 g，置于25 mL 棕色量瓶中，加入甲醇適量，超聲（功率250 W，頻率50 kHz）處理15 min，放至室溫，加甲醇至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.9.4線性關系考察 精密稱取沒食子酸對照品13.80 mg，置于25 mL 量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得552.0 μg·mL-1儲備液。分別精密吸取儲備液0.25、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL 于10 mL 量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得質量濃度分別為13.80、27.60、55.20、110.40、165.60、220.80 μg·mL-1的系列對照品溶液，各進樣10 μL，測定峰面積，以質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，沒食子酸標準曲線方程為Y=35 135.016 39X+9 487.378 89（r=0.999）。沒食子酸在13.80～220.80 μg·mL-1與峰面積呈良好的線性關系。

2.9.5精密度試驗 精密吸取沒食子酸對照品溶液（47.12 μg·mL-1），重復進樣6 次，每次10 μL，測定沒食子酸的峰面積，計算RSD。結果顯示，沒食子酸峰面積的RSD為0.069%，顯示精密度良好。

2.9.6重復性試驗 取沒食子1 號樣品0.1 g，精密稱定，按2.9.3項下方法制備供試品溶液6份，分別進樣測定，按干燥品計算沒食子酸含量，RSD 為1.29%，結果表明該方法的重復性良好。

2.9.7穩定性試驗 取沒食子1 號樣品0.1 g，精密稱定，按2.9.3 項下方法制備供試品溶液，分別于0、5、10、15、20、25 h 進樣測定，沒食子酸峰面積的RSD 為1.67%。說明供試品溶液室溫下25 h內具有良好的穩定性。

2.9.8加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的供試品0.05 g（沒食子酸質量分數為2.78%），共取9份，置于9個25 mL 棕色量瓶中，分別加入80%、100%、120%沒食子酸對照品溶液（沒食子酸質量濃度為55.79 μg·mL-1），按2.9.3 項下方法制備供試品溶液，分別進樣測定，計算回收率。結果沒食子酸平均回收率為101.6%，RSD為1.56%。結果見表2。

表2 沒食子中沒食子酸加樣回收率測定結果

2.9.9樣品測定 分別精密稱11 批不同產地沒食子粉末各0.1 g，按2.9.3項下方法制備供試品溶液，外標法計算含量。結果顯示，沒食子酸質量分數為1.52%～4.72%，平均值為2.90%，SD為±1.087 69。根據上述測定結果，暫定沒食子中含沒食子酸（C7H6O5）按干燥品計，應不得少于1.20%。結果見表3。

表3 11批沒食子樣品中沒食子酸質量分數（n=2）

3 討論

3.1 質量標準提高的意義和必要性

本研究為國家藥典委員會《中國藥典》品種質量標準修訂科研項目內容之一。沒食子原標準收載只有性狀、顯微和簡單試管鑒別。本研究對性狀和顯微鑒別作了全面修訂，刪除專屬性差的試管鑒別，增加了對照品、對照藥材的薄層色譜鑒別，增加了水分、總灰分、浸出物、HPLC 沒食子酸含量測定等項，使質量標準得到全面提高。經過多次復核，本研究沒食子質量標準起草的各項指標基本合理，方法可行，重復性較好。

3.2 薄層色譜條件的選擇

沒食子含鞣質、沒食子酸、丁香酸、鞣花酸（并沒食子酸）、沒食子酸甲酯等成分。針對沒食子酸、鞣花酸、沒食子酸甲酯及沒食子對照藥材進行了薄層色譜鑒別試驗。1）硅膠G薄層色譜：取本品粉末0.1 g，加甲醇20 mL，超聲（功率250 W，頻率50 kHz）處理20 min，濾過，濾液濃縮至2 mL 作為供試品溶液。取沒食子酸對照品加甲醇制成2 mg·mL-1的溶液，作為對照品溶液。照《中國藥典》2020 年版（四部）通則0502 薄層色譜法，吸取供試品溶液5 μL，對照品溶液2 μL，分別點于同一硅膠GF254 薄層板上，以二氯甲烷-甲酸乙酯-甲酸（5∶5∶1）為展開劑，展開，取出，揮干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照品和對照藥材色譜相應的位置上顯相同顏色的斑點。噴以1%三氯化鐵乙醇溶液，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上顯相同顏色的斑點。2）聚酰胺薄膜色譜：展開劑分別用50%乙醇和30%乙醇，50%乙醇效果優于30%乙醇；點樣量用1、2 μL，分別點狀和條狀點于同一聚酰胺薄膜上（進口、國產），結果點樣量1 μL 效果優于2 μL，條狀點樣效果優于點狀點樣。綜合考慮，方法2操作簡單、色譜斑點清晰、展開劑經濟且對環境污染小，故列入標準。薄層色譜耐用性考察結果表明，國產聚酰胺薄膜（上海試劑四廠）和進口聚酰胺薄膜（BDH chemicals Ltd Poole England）色譜斑點均清晰穩定，便于識別。

3.3 液相色譜條件選擇

謝成根等[12]采用流動注射化學發光增強法測定沒食子中沒食子酸質量分數為112.6 mg·g-1。楊建華等[13]報道分別采用HPLC、干酪素比色法測定沒食子藥材中沒食子酸和總鞣質質量分數分別為5.76%和42.85%。周露等[14]對沒食子藥材HPLC 指紋圖譜進行了研究。本研究對沒食子藥材中沒食子酸進行了HPLC含量測定，方法簡便易行。選用乙腈-0.5%磷酸水溶液（3∶97），流速為1.0 mL·min-1，柱溫為35 ℃，進行等度洗脫，沒食子峰基線分離，檢測時間為70 min，過長。故選用梯度洗脫，方法方便、快捷。經二極管陣列光譜掃描沒食子酸峰純正，紫外最大吸收波長為273 nm，故采用273 nm 為檢測波長。

3.4 供試品溶液的制備

實驗中考察了沒食子不同提取溶劑水、甲醇、95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、丙酮、50%丙酮，結果水、甲醇、50%乙醇提取液的沒食子酸峰可基線分離，因此進行了水提取液、甲醇提取液24 h 穩定性考察，結果沒食子酸在甲醇中24 h 內穩定，在水中不穩定，24 h 內沒食子酸的質量分數由2.87%增加到4.11%，RSD 為14.35%，隨著時間的推移鞣質類水解生成更多游離的沒食子酸，所以本樣品的提取不適合使用含水溶劑，故選用甲醇為提取溶劑。實驗中考察了不同超聲提取時間（15、20、25、30、40 min），結果超聲15、40 min 時沒食子酸含量基本穩定，為節省時間，選擇15 min。

3.5 液相色譜耐用性考察

考察了不同流速（0.8、1.0、1.2 mL·min-1）、不同柱溫（30、35、40 ℃）、不同色譜柱Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）和Wondasil-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、不同品牌儀器（島津LC-20AT 型高效液相色譜儀和安捷倫1260 型高效液相色譜儀）、不同實驗室（新疆維吾爾自治區藥品檢驗研究院和上海市食品藥品檢驗所），結果表明耐用性均較好。