超聲波協(xié)同纖維素酶提取紫蘇葉多糖的工藝條件優(yōu)化及抗氧化活性分析

梁樂(lè)欣，黃曉辰，黃曉婷

（肇慶學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，廣東肇慶 526061）

紫蘇葉具有獨(dú)特的氣味，是我國(guó)南方常見的調(diào)味品。同時(shí)，紫蘇也是我國(guó)傳統(tǒng)的中草藥之一，已被我國(guó)衛(wèi)生部列為藥食兩用的中藥之一[1]，具有很高的研究?jī)r(jià)值。經(jīng)現(xiàn)代藥理學(xué)研究，紫蘇已經(jīng)分離鑒定出酚酸類、脂肪酸類、甾醇類、揮發(fā)油類、黃酮類化合物等化學(xué)成分100余種，具有多方面的生物活性，如解熱鎮(zhèn)靜、抗炎、抗過(guò)敏、抗氧化、促進(jìn)記憶等[2]。有研究表明，紫蘇多糖具有改善游泳行為和單胺類神經(jīng)遞質(zhì)異常的作用，同時(shí)還能吞噬金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和部分革蘭氏陽(yáng)性及革蘭氏陰性細(xì)菌[3]。

常見的多糖提取方法有超聲提取法、熱水直接浸提法、酶提取法、微波提取法等。紫蘇葉細(xì)胞壁的主要成分是纖維素，利用纖維素酶水解細(xì)胞壁，使更多胞內(nèi)多糖溶出[3]。超聲波則是利用空化作用、熱效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)等加快有效物質(zhì)溶于溶劑，使多糖的提取率提高[4]。結(jié)合纖維素酶法和超聲提取法，以紫蘇干葉為原料提取紫蘇葉粗多糖，并利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化多糖提取的工藝參數(shù)，使多糖浸出率提高，為對(duì)紫蘇葉粗多糖的進(jìn)一步研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫蘇干葉，康美藥業(yè)股份有限公司提供；纖維素酶，上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供；乙酸鈉、冰乙酸、鹽酸、過(guò)硫酸鉀、三氯乙酸、氯化鈉等，均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

V-1100D型紫外-可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司產(chǎn)品；KX-1613T型超聲波清洗機(jī)，北京科璽世紀(jì)科技有限公司產(chǎn)品；DS-Y500A型高速多功能粉碎機(jī)，上海頂帥電器有限公司產(chǎn)品；HHS型電熱恒溫水浴鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；DHG-9145A型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；TG16-WS型高速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品。

1.3 工藝流程

紫蘇葉→洗凈、烘干→粉碎、過(guò)篩→纖維素酶處理→超聲處理→離心→上清液→濃縮→醇沉→離心沉淀→干燥→多糖粗品。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 紫蘇干葉粗多糖提取

稱取1 g經(jīng)粉碎過(guò)篩的紫蘇干葉，加入pH值4.8的緩沖溶液30 mL和一定量的纖維素酶，在一定的溫度和時(shí)間條件下酶解，在沸水浴中滅酶0.5 h。放入超聲清洗機(jī)中超聲一定的時(shí)間后，得到紫蘇葉粗多糖提取液。將提取液真空濃縮，加入80%乙醇醇沉后，以轉(zhuǎn)速4 000 r/s離心30 min，真空干燥后制得多糖粗品。

1.4.2 制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

利用蒽酮-硫酸法[5-6]，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。將編號(hào)為1～9的10 mL具塞試管中分別移取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9 mL，分別加水至2 mL，搖勻，加入6 mL蒽酮試劑（0.1 g蒽酮溶于100 mL 80%H2SO4），沸水浴15 min，冷水浴30 min，室溫下放置至常溫。用水作空白對(duì)照，于波長(zhǎng)620 nm處測(cè)定吸光度。以質(zhì)量濃度和吸光度分別作為橫縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的回歸方程設(shè)為公式（1）。

1.4.3 樣品多糖含量的測(cè)定

將多糖粗品用蒸餾水定容至100 mL，從中吸取4 mL定容至100 mL作為待測(cè)樣液。從樣液中吸取2 mL，測(cè)定于波長(zhǎng)620 nm處的吸光度，利用公式（2）計(jì)算換算系數(shù)f，

式中：W——紫蘇葉多糖的質(zhì)量，μg；

D——紫蘇葉多糖的稀釋倍數(shù)；

C——多糖溶液中葡萄糖的質(zhì)量濃度，μg/mL。再利用公式（3），計(jì)算多糖提取率：

式中：C——樣品溶液中葡萄糖質(zhì)量濃度，μg/mL；

D——樣品溶液稀釋倍數(shù)；

f——換算系數(shù)；

m——紫蘇葉干粉質(zhì)量，g。

1.4.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選取酶解時(shí)間、酶解溫度、加酶量和超聲時(shí)間4個(gè)因素，考查其對(duì)紫蘇多糖提取的結(jié)果影響。其中，酶解時(shí)間為20，30，40，50，60 min 5個(gè)水平；酶解溫度為35，40，45，50，55℃5個(gè)水平；加酶量為1 000，1 200，1 400，1 600，1 800 U/g 5個(gè)水平；超聲時(shí)間為20，30，40，50，60 min 5個(gè)水平，分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.4.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

運(yùn)用Box-behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)酶解時(shí)間、酶解溫度、加酶量和超聲時(shí)間4個(gè)影響因素進(jìn)行優(yōu)化，影響因素的低、中、高水平分別用-1，0，1表示，進(jìn)行響應(yīng)面分析。

1.4.6 羥基自由基清除率測(cè)定

移取0.5 mL樣品于試管中，加入濃度為100 mmol/L pH值7.4的PBS緩沖液2.5 mL，混勻后加入濃度為1 mmol/L的鄰二氮菲溶液1.5 mL，濃度為9 mmol/L的FeSO4溶液0.5 mL，立即混勻[7]。加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的H2O2溶液0.5 mL啟動(dòng)反應(yīng)，于37℃下保溫1 h，測(cè)定波長(zhǎng)536 nm處的吸光度A。再以質(zhì)量濃度為2 g/L抗壞血酸溶液作對(duì)比試驗(yàn)，其中A管以不加H2O2的管調(diào)零，用PBS緩沖液調(diào)零A1和A2管。重復(fù)測(cè)定3次，計(jì)算清除率。下式中，A1為加入1.0 mL水代替提取液和雙氧水的管的吸光度；A2為加入0.5 mL水代替提取液的管的吸光度。以抗壞血酸作為對(duì)照組，清除率按公式（4）計(jì)算。

1.4.7 DPPH自由基清除率測(cè)定

用無(wú)水乙醇配制0.2 mmol/L的DPPH溶液，準(zhǔn)確吸取1.5 mL樣品待測(cè)溶液和0.2 mmol/L DPPH溶液0.5 mL，搖勻后在室溫下避光放置30 min，測(cè)量波長(zhǎng)517 nm處的吸光度，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次[8]。下式中，A0為DPPH溶液0.5 mL加蒸餾水1.5 mL的吸光度；A1為樣品溶液1.5 mL加DPPH溶液0.5 mL的吸光度；A2為樣品溶液1.5 mL加無(wú)水乙醇0.5 mL的吸光度。按照公式（5）計(jì)算各待測(cè)樣品對(duì)DPPH自由基的清除率，并用抗壞血酸做對(duì)照組。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

以葡萄糖質(zhì)量濃度、吸光度分別作為橫縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程Y=4.621 8X+0.055 3，R2=0.997 9。結(jié)果表明，無(wú)水葡萄糖在質(zhì)量濃度為0～0.5 mg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 酶解時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

在超聲時(shí)間50 min，加酶量1 000 U/g，酶解溫度40℃條件下，研究酶解時(shí)間20，30，40，50，60 min對(duì)多糖提取率的影響。

酶解時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響見圖2。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

由圖2可知，當(dāng)酶解時(shí)間為20～30 min時(shí)，提取率隨著時(shí)間增加而增加，說(shuō)明酶與底物充分反應(yīng)，在30 min時(shí)多糖提取率最高，當(dāng)酶解時(shí)間為30～60 min時(shí)，提取出的多糖可能出現(xiàn)分解現(xiàn)象，使紫蘇葉多糖的提取率逐漸下降。

2.2.2 酶解溫度對(duì)多糖提取率的影響

在超聲時(shí)間50 min，加酶量1 000 U/g，酶解時(shí)間30 min條件下，研究酶解溫度20，30，40，50，60℃對(duì)多糖提取率的影響。

酶解溫度對(duì)多糖提取率的影響見圖3。

圖3 酶解溫度對(duì)多糖提取率的影響

由圖3可知，當(dāng)酶解溫度在30℃時(shí)，提取率最大；當(dāng)酶解溫度為30～60℃時(shí)，纖維素酶受熱，活性降低，催化能力減弱，提取率呈下降趨勢(shì)。由此可知，酶的最適溫度大約為30℃，此時(shí)酶的活性最大，水解反應(yīng)進(jìn)行得更順利。

2.2.3 加酶量對(duì)多糖提取率的影響

在超聲時(shí)間50 min，酶解時(shí)間30 min，酶解溫度30℃的條件下，研究加酶量0，500，1 000，1 500，2 000 U/g對(duì)多糖提取率的影響。

加酶量對(duì)多糖提取率的影響見圖4。

圖4 加酶量對(duì)多糖提取率的影響

由圖4可知，當(dāng)加酶量為0～1 500 U/g時(shí)，紫蘇葉多糖提取率隨加酶量的增加而提高；當(dāng)加酶量為1 500 U/g時(shí)，提取率最大；當(dāng)加酶量為1 500～2 000 U/g時(shí)，可能由于多余的纖維素酶沒(méi)有反應(yīng)底物，提取率隨加酶率增加不再提高。

2.2.4 超聲時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

在加酶量1 500 U/g，酶解溫度30℃，酶解時(shí)間30 min條件下，研究超聲時(shí)間20，30，40，50，60 min對(duì)多糖提取量的影響。

超聲時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響見圖5。

圖5 超聲時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

由圖5可知，當(dāng)超聲時(shí)間為50 min時(shí)，多糖得率最高；當(dāng)超聲時(shí)間延長(zhǎng)，超聲波的熱效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)會(huì)分解破壞多糖，使多糖提取率降低[9]。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 Box-behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

由單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，酶解時(shí)間為30 min，酶解溫度為30℃，加酶量為1 500 U/g，超聲時(shí)間為50 min時(shí)，多糖提取率接近最大值。以這些數(shù)值作為中間值，設(shè)定合理區(qū)域，利用Box-behnken響應(yīng)面法對(duì)提取工藝進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)水平見表1，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)水平

2.3.2 模型回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，此模型與該試驗(yàn)擬合良好，模型的p=0.046 7＜0.05，表明此試驗(yàn)?zāi)Ｐ筒町愶@著，失擬項(xiàng)p=0.289 4＞0.05，說(shuō)明失擬項(xiàng)檢驗(yàn)不顯著，方程對(duì)試驗(yàn)的擬合度較好。

模型回歸系數(shù)顯著性見表3。

表3 模型回歸系數(shù)顯著性

2.3.3 因素相互影響的響應(yīng)面分析

根據(jù)數(shù)據(jù)模型所得響應(yīng)曲面可以直觀反映因素或因素之間的交互作用對(duì)紫蘇葉多糖得率影響的強(qiáng)弱，等高線呈橢圓形時(shí)因素之間交互作用強(qiáng)，等高線越圓交互作用越弱。響應(yīng)曲面越陡峭，則表示對(duì)提取率的影響越大。

酶解時(shí)間（A）與酶解溫度（B）對(duì)多糖提取率影響的響應(yīng)面圖見圖6，酶解時(shí)間（A）與加酶量（C）對(duì)多糖提取率影響的響應(yīng)面圖見圖7，酶解時(shí)間（A）與超聲時(shí)間（D）對(duì)多糖提取率影響的響應(yīng)面圖見圖8，酶解溫度（B）與加酶量（C）對(duì)多糖提取率影響的響應(yīng)面圖見圖9，酶解溫度（B）與超聲時(shí)間（D）對(duì)多糖提取率影響的響應(yīng)面圖見圖10，加酶量（C）與超聲時(shí)間（D）對(duì)多糖提取率影響的響應(yīng)面圖見圖11。

圖6 酶解時(shí)間（A）與酶解溫度（B）對(duì)多糖提取率影響的響應(yīng)面圖

圖7 酶解時(shí)間（A）與加酶量（C）對(duì)多糖提取率影響的響應(yīng)面圖

由圖6可知，因素A對(duì)多糖提取率的影響略大于因素B，而且因素A與因素B之間的交互影響也大。由圖7可知，因素A與因素C對(duì)多糖提取率的影響都比較大，且因素C大于因素A，兩者交互影響不大。由圖8可知，因素D對(duì)多糖提取的影響不顯著，小于因素A對(duì)多糖提取率的影響，因素D與因素A交互影響較大。由圖9可知，因素C對(duì)多糖提取率的影響大于因素B，且因素C與因素B交互影響小。由圖10可知，因素D對(duì)多糖提取率的影響小于因素B，且因素D與因素B交互影響小。由圖11可知，因素C對(duì)多糖提取率的影響大于因素D，且因素C與因素D交互影響大。

圖8 酶解時(shí)間（A）與超聲時(shí)間（D）對(duì)多糖提取率影響的響應(yīng)面圖

圖9 酶解溫度（B）與加酶量（C）對(duì)多糖提取率影響的響應(yīng)面圖

圖10 酶解溫度（B）與超聲時(shí)間（D）對(duì)多糖提取率影響的響應(yīng)面圖

綜合圖6～圖11可得，各因素對(duì)多糖提取率的影響程度為因素C＞因素A＞因素B＞因素D，且因素A與因素B、因素A與因素D、因素C與因素D之間交互影響大。

圖11 加酶量（C）與超聲時(shí)間（D）對(duì)多糖提取率影響的響應(yīng)面圖

2.3.4 最優(yōu)值預(yù)測(cè)及最優(yōu)工藝驗(yàn)證

經(jīng)Design Expert軟件分析，數(shù)學(xué)模型最優(yōu)提取率為4.539%，預(yù)測(cè)條件為加酶量2 000 U/g，酶解溫度20.4℃，酶解時(shí)間40 min，超聲時(shí)間60 min，在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)。

最優(yōu)工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 最優(yōu)工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果/%

由試驗(yàn)可得，多糖平均提取率為4.488 2%，實(shí)際值與最優(yōu)工藝預(yù)測(cè)值偏差為1.12%，表明Design Expert建立的數(shù)學(xué)模型可以用于優(yōu)化紫蘇葉多糖的提取工藝。因此，由Box-behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)得到的優(yōu)化的工藝條件準(zhǔn)確可靠。

2.4 紫蘇葉多糖抗氧化活性分析

2.4.1 紫蘇葉多糖溶液清除DPPH自由基的能力

紫蘇葉多糖溶液清除DPPH自由基的能力見圖12。

圖12 紫蘇葉多糖溶液清除DPPH自由基的能力

DPPH自由基能與抗氧化物提供的一個(gè)電子配對(duì)使其特征紫色消失，可根據(jù)其褪色程度來(lái)間接評(píng)價(jià)抗氧化物的抗氧化能力[10]。由圖12可知，紫蘇葉多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力隨著多糖質(zhì)量濃度的增加逐漸增大，并呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系[11]，在質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到94.17%，略低于同質(zhì)量濃度抗壞血酸溶液的DPPH自由基清除率；當(dāng)質(zhì)量濃度高于0.2 mg/mL時(shí)，略高于同濃度抗壞血酸溶液的DPPH自由基清除率。

2.4.2 紫蘇葉多糖溶液清除羥基自由基的能力

紫蘇葉多糖溶液清除羥基自由基的能力見圖13。

由圖13可知，紫蘇葉多糖對(duì)羥基自由基有清除作用，當(dāng)紫蘇葉多糖質(zhì)量濃度為0.1～1.0 mg/mL時(shí)，隨著質(zhì)量濃度增加，紫蘇葉多糖清除羥基自由基的能力增強(qiáng)；當(dāng)多糖質(zhì)量濃度在0.2～1.0 mg/mL時(shí)，其對(duì)羥基自由基清除率都高于同質(zhì)量濃度抗壞血酸溶液對(duì)羥基自由基的清除率。

圖13 紫蘇葉多糖溶液清除羥基自由基的能力

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)面法對(duì)超聲波協(xié)同纖維素酶提取紫蘇葉多糖的條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了適當(dāng)有效的二次多項(xiàng)模型。優(yōu)化的最佳工藝條件為加酶量2 000 U/g，酶解溫度20.4℃，酶解時(shí)間40 min，超聲時(shí)間60 min，在此條件下紫蘇葉多糖的提取率為4.539%。對(duì)所提取紫蘇葉多糖的抗氧化試驗(yàn)顯示，隨著質(zhì)量濃度的增加，其清除DPPH自由基和羥自由基的能力逐漸增強(qiáng)，在質(zhì)量濃度0.1 mg/mL時(shí)其DPPH自由基清除率達(dá)到94.17%，在質(zhì)量濃度1.0 mg/mL時(shí)羥自由基清除率達(dá)到90.06%。超聲波法和纖維素酶法結(jié)合提取紫蘇葉多糖，具有高效、短時(shí)、作用條件溫和、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)[12]。