基于UPLC-QTOF MS的魚類鰓靶器官代謝組學分析方法研究

劉英杰，姚明珠，李姍蔚，陳中祥，王 鵬，孫言春*

（1.上海海洋大學 食品學院，上海 201306；2.中國水產科學研究院 黑龍江水產研究所，黑龍江 哈爾濱 150010）

代謝組學是研究生物體系受到外部刺激或擾動后內源性代謝物的整體改變及變化規律的一門科學［1］。作為系統生物學的重要組成部分，隨著高通量高分辨率分析技術的不斷成熟，代謝組學發展迅速，現已在藥物毒理、臨床疾病及食品營養等領域得到了廣泛應用。由于代謝組學可以揭示生物系統在細胞層面的變化規律，從整體上闡明特定性狀發生發展的物質基礎和調控機制，因此為包括水生動物在內的良種繁育以及抗逆應激機制研究提供了一種新的有效手段。近年來，代謝組學技術在水產科學中的研究備受關注［2-5］。

目前，代謝組學常用的分析技術主要包括液相色譜-質譜聯用［6-7］、氣相色譜-質譜聯用（GCMS）［8-9］、核磁共振（NMR）［10-11］等。其中，以超高效液相色譜-三重四極桿飛行時間質譜（UPLCQTOF MS）為代表的液相色譜-質譜聯用技術因高靈敏度、高通量、高特異性、高分辨率和掃描速度等特點已成為代謝組學分析的重要手段。就分析步驟而言，常規的代謝組學實驗流程主要包括樣本的收集和前處理、代謝組數據的采集、數據預處理、數據統計分析、標志物識別和通路分析等。由于生物樣品中所含物質種類豐富，而其中代謝物的豐度和極性呈現高度差異性，因此，規范的樣本前處理與數據采集方法在提高代謝物數據的覆蓋率、準確性、穩定性過程中起著決定性的作用［12］。

作為魚類參與呼吸、離子和滲透調節、酸堿平衡和氨氮排泄的主要功能器官，鰓與周圍水環境有著直接和持續的相互作用，在環境適應、應激下的生理調控中扮演著重要角色［13］。由于鰓組織中的代謝物具有種類繁多、化學結構多樣、極性差異較大等特點，因而對其代謝組學的全面分析提出了巨大挑戰。目前，雖有一些研究對血清［14］、血漿［15］、腎臟［16］、胚胎［17］等樣品的代謝組學分析方法進行了探討，但仍然缺乏對于鰓這一水生動物特定器官的代謝組學分析優化方案。鰓代謝組學前處理以及數據采集的各方法中，尚未達到更好的覆蓋范圍和穩定性。因此，亟需建立一種適用于鰓樣品的代謝組學分析方法，用于解析鰓靶器官在魚類生物功能中的科學內涵。

本研究采用UPLC-QTOF MS 技術作為分析手段，利用蛋白質沉淀法對鯽鰓組織樣品中的代謝物進行提取，通過反相C18色譜柱對代謝物進行色譜分離，并以葡萄糖、L-亮氨酸、檸檬酸、8-羥基二十碳四烯酸（8-HETE）、溶血磷脂酰膽堿（18∶0）（LysoPC（18∶0））、尿苷6 種不同極性的代表性內源代謝物為研究對象，以代謝物的覆蓋率、穩定性為指標，結合質量控制（QC）樣本評價方法，建立了適用于魚鰓靶器官中小分子代謝物全面分析的代謝組學分析方法。該方法對鰓組織樣品中廣極性代謝物的覆蓋面寬，具有提取率高、穩定性強、專屬性強、靈敏度高等特點，適用于開展魚類代謝組學研究。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITY UPLC 超高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；SCIEX Triple TOF 5600 plus 高分辨質譜儀（美國AB SCIEX公司）；Allegra X-30R高速離心機（美國Beckman公司）；高通量組織研磨機（寧波新芝生物有限公司）；渦旋混勻器（德國IKA公司）；數控超聲儀（昆山超聲儀器有限公司）；XS205DY電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；YP-2002 電子天平（上海越平公司）；Milli-Q A10 超純水機（美國Millipore公司）。

甲醇（MeOH）、乙腈（ACN）（質譜純，德國Merck 公司）；甲酸（色譜純，德國Merck 公司）；0.22μm 有機相濾膜（上海安譜公司）；間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽（MS-222）（美國Sigma-Aldrich 公司）；生理鹽水（四川科倫藥業公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物與樣品采集本實驗所用銀鯽取自哈爾濱市方正縣方正銀鯽國家良種場。選擇大小均一、健康無外傷且遺傳背景一致的銀鯽50 尾，體長約（13.0±0.5）cm，質量約（120.10±5.64）g，將其轉移至室內溫控循環養殖設備中。每天保持12 ～14 h 的光照，水溫23 ～24 ℃，按照三定三巡（定時定點定量投喂、早中晚巡查）的管理模式馴養15 d。采樣前24 h 停止喂食，將魚轉移至100 mg/L 的MS-222 溶液中深度麻醉后置于冰上解剖，快速采集鰓組織，用生理鹽水清洗表面血液后立即置于凍存管中液氮速凍，之后轉移至-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 樣品預處理取出-80 ℃下保存的鰓組織樣品于4 ℃下解凍，準確稱取50 mg于1.5 mL離心管中，加入800μL的4 ℃預冷甲醇-水（4∶1）和3個小鋼珠，-20 ℃下以60 Hz的速度低溫研磨3 min，于-20 ℃靜置30 min后，在4 ℃下以13000 r/min離心15 min，取500μL上層溶液，經0.22μm有機濾膜過濾至進樣瓶中待測。在此過程中，將所有樣品等量混合制備QC樣品，用于方法學考察。

1.2.3 UPLC-QTOF MS檢測采用Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7μm），流動相A 為0.1%甲酸水溶液，流動相B 為0.1%甲酸乙腈溶液，流速為0.30 mL/min。洗脫梯度：0 ～2 min，5%～20%B；2～3 min，20%～60%B；3 ～11 min，60%～80%B；11 ～12 min，80%～100%B；12 ～13 min，100%B；13 ～13.1 min，100%～5%B；13.1 ～15 min，5%B。柱溫為35 ℃，自動進樣室溫度為4 ℃，進樣量為10μL。

離子源采用電噴霧（ESI）源，在正、負離子模式下掃描數據。TOF MS Scan 模式m/z范圍為100 ～1200 Da；離子源溫度：550 ℃；離子化電壓：5500 V/-4500 V（正/負離子模式）；氣簾氣（CUR）：241.3 kPa；噴霧氣（GAS）：344.7 kPa；去簇電壓（DP）：80 eV；碰撞能量（CE）：10 eV。信息依賴采集（IDA）法進行二級質譜數據采集的m/z范圍為50 ～1200 Da，開啟動態背景扣除（DBS），DP：80 eV；CE：（35±15）eV。每隔5個樣品采集1次QC樣品，以評估數據質量。

1.2.4 數據處理將正、負離子模式下采集的數據導入數據處理軟件Progenesis QI（美國Waters 公司），對色譜峰進行譜峰識別、峰對齊、峰過濾等數據預處理程序。隨后，使用HMDB（http：//www.hmdb.ca/）與LIPID MAPS（https：//www.lipidmaps.org/）公共數據庫對代謝物進行注釋。最后輸出由保留時間、精確質荷比、樣本名稱、代謝物名稱和峰面積組成的數據矩陣，導入多變量統計軟件SIMCA 14.1進行主成分分析（PCA）。

2 結果與討論

2.1 樣品前處理方法的優化

代謝物的提取質量是影響代謝組學分析的關鍵因素，因而樣品前處理步驟至關重要。在動物的代謝組學分析中，代謝物種類繁多，且不同代謝物之間的化學性質差異大。提取過程中必須兼顧不同代謝物的理化性質，盡可能高質量地獲得樣本中代謝物的全部信息。提取溶劑的種類、用量以及提取溫度等關鍵參數會對代謝物的提取結果產生影響，因此本研究對上述參數進行了優化。

2.1.1 提取溶劑種類的選擇代謝組學分析中，不同種類的提取溶劑對代謝物的極性選擇范圍不同。因此，提取溶劑種類是影響內源性代謝物的數量、種類和信號強度的主要因素之一［18］。以圖譜總峰面積、檢測到的代謝物數目、相對峰面積的相對標準偏差（RSD）以及代表性代謝物的信號強度為指標，考察了MeOH、ACN、MeOH-ACN（1∶1，體積比，下同）、MeOH-H2O（4∶1）、MeOH-H2O（7∶3）5 種提取溶劑的提取效果。

首先，將正、負離子模式下獲得的UPLC-QTOF MS 原始數據導入Progenesis QI 軟件進行數據預處理，得到不同提取溶劑下檢測的總峰面積。結果如圖1A所示，采用MeOH-H2O（4∶1）提取處理后，鰓組織樣品經UPLC-QTOF MS檢測的圖譜總峰面積最大，且與除MeOH-H2O（7∶3）以外的3種提取溶劑之間存在顯著差異。隨后，使用公共數據庫對代謝物進行注釋，并計算各代謝物在不同樣本間相對峰面積的RSD，以考察不同提取溶劑的平行性。結果如圖1B 所示，采用MeOH、ACN、MeOH-ACN（1∶1）、MeOH-H2O（4∶1）、MeOH-H2O（7∶3）為提取溶劑分別鑒定出528、564、513、598和581種代謝物。在代謝組學分析中，代謝物的相對峰面積RSD ＜30%時，表明其特征較穩定［19］。相較而言，采用MeOH-H2O（4∶1）作為提取溶劑獲得的代謝物數目最多，覆蓋率最大，且相對峰面積RSD ＜30%的代謝物占比最大。選取葡萄糖、L-亮氨酸、檸檬酸等6種代表性內源代謝物，進一步考察了碳水化合物、氨基酸、甘油酯、有機酸等不同種類與極性的代謝物采用上述提取溶劑時的信號強度。結果如圖1C所示，除LysoPC（18∶0）外，其余代表性代謝物采用MeOH-H2O（4∶1）為提取溶劑可獲得更高的相對信號強度。綜上，本研究最終選擇MeOH-H2O（4∶1）作為提取溶劑。

圖1 提取溶劑種類對鰓代謝物提取結果的影響Fig.1 The influence of extraction solvent type on the extraction results of gill metabolitesA. total peak area of TIC；B. the number of metabolites and RSD distribution；C. relative signal abundance of representative metabolites with different polarities；different letters in Fig.1A indicate significant differences among the treatment groups（p ＜0.05）

2.1.2 提取溶劑用量的選擇提取溶劑的用量直接影響樣品中蛋白質的去除效果和小分子代謝物的溶出效率，參考相關文獻［20-22］，本實驗考察了樣品-試劑比（mg∶μL）分別為1∶13、1∶16、1∶20 和1∶25時對鰓組織中代謝物提取效果的影響。

結果表明，樣品-試劑比（mg∶μL）為1∶16 時獲得的圖譜總峰面積最大，且與1∶20 和1∶25 兩組之間存在顯著差異（圖2A）。樣品-試劑比為1∶13、1∶16、1∶20 和1∶25 時分別鑒定出564、580、497 和472 種代謝物，其中樣品-試劑比為1∶16 時獲得的代謝物數量最多，且相對峰面積RSD ＜30%的代謝物占比最大，穩定性良好（圖2B）。進一步考察了6 種代謝物在上述樣品-試劑比例下的信號強度，結果顯示，各代謝物在樣品-試劑比為1∶16 時的相對信號強度更高（圖2C）。綜上，本研究最終選擇樣品-試劑比（mg∶μL）為1∶16。

圖2 提取溶劑用量對鰓代謝物提取結果的影響Fig.2 The influence of extraction solvent amount on the extraction results of gill metabolitesA. total peak area of TIC；B. the number of metabolites and RSD distribution；C. relative signal abundance of representative metabolites with different polarities；different letters in Fig.2A indicate significant differences among the treatment groups（p ＜0.05）

2.1.3 提取溫度的選擇在代謝組學樣品前處理過程中，提取溫度顯著影響小分子代謝物的提取效果。提取溫度過高可能影響蛋白質的沉淀效果，并導致代謝物降解。為進一步提高代謝物的提取效果，本研究對提取溫度進行了優化。分別考察3 種不同方法對代謝物提取效果的影響：①鰓組織中加入常溫（25 ℃）提取溶劑進行研磨；②鰓組織中加入4 ℃預冷后的提取溶劑進行常溫研磨；③鰓組織中加入4 ℃預冷后的提取溶劑，在-20 ℃下進行低溫研磨后，置于-20 ℃環境中靜置30 min。

結果顯示，采用方法③獲得的圖譜總峰面積最大，且與其它兩種方法存在顯著差異。就代謝物數目而言，上述3種提取條件下分別獲得459、530、583種代謝物。采用方法③獲得的代謝物數量最多，且相對峰面積RSD ＜30%的代謝物占比最大，體現出更好的穩定性。同時對6種代表性代謝物在不同提取溫度下的信號強度進行了評估，結果顯示，采用方法③時，6種代謝物均可獲得最強的相對信號強度。

綜上所述，最佳前處理方法為：樣品-試劑比（mg∶μL）為1∶16，以4 ℃預冷的MeOH-H2O（4∶1）作為提取溶劑，在-20 ℃下進行低溫研磨后，置于-20 ℃環境中靜置30 min。

2.2 色譜與質譜條件的優化

2.2.1 色譜條件的優化采用Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm ×2.1 mm，1.7μm），分別考察了流動相種類、柱溫、流速、進樣量等條件對色譜分離效果的影響。

為避免基質干擾，優化目標峰的保留時間，比較了甲醇-水、乙腈-水、0.1%甲酸甲醇-0.1%甲酸水、0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水4種流動相對代謝物分離效果的影響。結果表明，流動相B為乙腈時代謝物的響應強度優于甲醇。而甲酸的加入有利于分析物形成［M+H］+，提高正離子檢測模式下的離子化效率，同時可顯著改善負離子檢測模式下的色譜峰形，減少色譜峰拖尾。雖然酸性流動相對負離子檢測模式下的信號強度略有抑制，但其減小程度不顯著。因此本實驗選擇0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相。

對柱溫及流速的考察結果發現，柱溫為35 ℃，流速為0.30 mL/min 時可獲得較好的分離效果。對樣品進樣量的考察結果發現，增加進樣量可提高代謝物的響應強度，但流動相系統的壓力會有明顯波動，導致干擾色譜峰無序出現，甚至影響目標色譜峰。最終，本實驗選擇最佳進樣量為10μL。

2.2.2 質譜條件的優化UPLC-QTOF MS系統使用電噴霧離子源（ESI），為提高質譜響應強度及靈敏度，本實驗選擇前述6種代表性內源代謝物對離子源溫度、離子源噴霧電壓、氣簾氣、噴霧氣、去簇電壓、碰撞能量等質譜參數進行了優化，最終得到優化的質譜采集條件如“1.2.3”所示。

經色譜、質譜條件優化后，正、負離子模式下鰓組織樣品中6種代謝物的總離子流色譜圖（TIC）如圖3所示。結果表明，各色譜峰的分離效果良好，響應值得到了顯著提升。

圖3 UPLC-QTOF MS分析獲得的鰓組織代謝物總離子流色譜圖Fig.3 Total ion chromatograms（TIC）of gill metabolites obtained by UPLC-QTOF MSA. positive ion mode；B. negative ion mode

2.3 方法學評價

2.3.1 儀器精密度按照優化后的樣品前處理與儀器分析方法，對同一QC 樣品連續進樣6 次，進行UPLC-QTOF MS分析。表1結果顯示，6種代表性代謝物相對峰面積的RSD為2.2%～4.2%，保留時間的RSD為1.2%～2.4%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 方法精密度按照優化后的樣品前處理與儀器分析方法，取6 份QC 平行樣品，進行UPLCQTOF MS分析，并將獲得的數據進行PCA分析。表1結果表明，6種代表性代謝物相對峰面積的RSD為3.4%～6.8%，保留時間的RSD為1.4%～4.6%。6個QC平行樣本在正、負離子模式下的一維PCA圖如圖4A、4B所示，各樣本的偏差均在2倍標準偏差（Std）范圍內。取10份普通樣品同時進行UPLC-QTOF MS分析，在正、負離子模式下獲得的二維PCA 圖如圖4C、4D 所示，正、負離子模式下各QC 樣本在小范圍內表現出高度的聚集性。結果表明該方法的精密度和重復性良好。

表1 儀器精密度、方法精密度和樣品穩定性實驗結果（n=6）Table 1 Results of instrument precision，method precision and sample stability tests（n=6）

圖4 QC樣本的一維PCA圖（A、B）與二維PCA圖（C、D）Fig.4 One-dimensional PCA plots（A，B）and two-dimensional PCA plots（C，D）of QC samplesA，C：in positive ion mode；B，D：in negative ion mode

2.3.3 樣品穩定性取同一QC 樣品，分別在0、6、12、24、48、72 h，按照優化后的樣品前處理與儀器分析方法進行UPLC-QTOF MS 分析。表1 結果表明，6 種代表性代謝物相對峰面積的RSD 為3.8%～10%，保留時間的RSD為3.4%～8.1%，表明該方法處理的樣品在72 h內具有良好的穩定性。

2.4 方法的初步應用

應用該方法系統性地開展了鯽鰓靶器官代謝組學研究［23］。結果顯示，依據本方法可定性的代謝物數量平均達8000余種。對其中的高質量物質進行統計，二級定性物質數量均超過600余種。捕獲代謝物包括氨基酸類、碳水化合物類、有機酸及其衍生物類、核苷酸及其類似物、甘油酯類等二十余種。與同類研究相比，所獲得的代謝物數目更多，覆蓋范圍廣泛且無偏向性。在后續的差異代謝物篩選分析過程中，共篩選出顯著差異代謝物200余種，而前期采用未經優化的方法僅篩選出100余種。本方法發現的差異代謝物數量提高了1 倍以上，從而顯著提高了發現代謝性生物標記物的概率，為開展魚類鰓靶器官代謝組學研究提供了可靠的方法學依據。

3 結論

本研究針對魚類鰓靶器官代謝組學分析過程中存在的科學問題，對影響樣品前處理以及儀器分析過程中的關鍵因素開展了系統研究，建立了一種基于UPLC-QTOF MS 檢測技術的魚類鰓組織代謝組學分析方法。結果表明，該方法具有精密度高、穩定性好、特異性強等特點，符合高通量代謝組學研究的基本要求。研究結果為各種魚類鰓靶器官的高通量代謝組學研究提供了技術支持，可為解析鰓器官在細胞層面發生的代謝調控規律提供方法學基礎，具有重要的現實科學意義。