以殼聚糖為基底的分子印跡電化學傳感器研究及倍硫磷測定

凌 俊，楊光煒，李建平，2*

（1.桂林理工大學 環境科學與工程學院，廣西 桂林 541004；2.桂林理工大學 化學與生物工程學院，廣西 桂林 541004）

倍硫磷是一種中等毒性、應用廣泛、殘效期長的有機磷殺蟲劑［1］，其在環境中具有一定的持久性，可通過進入水體和食物鏈對人和動物構成威脅［2-3］。因此，環境中倍硫磷的檢測受到人們的廣泛關注。目前常用的倍硫磷檢測方法主要有氣相色譜法［4］、液相色譜法［5］、色譜-質譜聯用法等［6］，但這些方法對復雜樣品中微量物質的測定存在耗時，樣品處理過程繁雜，且需要復雜的大型儀器以及訓練有素的專業檢測人員等缺點［7］，難以用于日常篩查。因此，急需開發一些成本低、操作簡單、選擇性好、靈敏度高的農藥分析方法。

分子印跡聚合物（MIP）電化學傳感器集分子印跡技術的高效識別特性與電化學分析靈敏度高、檢測快速、儀器簡便、易于小型化等優點于一體，廣泛應用于環境樣品中微量污染物的分析測定［8-11］。但利用MIP 電化學傳感器測定倍硫磷少有文獻報道［12］，已有方法的靈敏度低（檢出限僅為0.05μg/g），不能滿足痕量倍硫磷的檢測要求。提高MIP 電化學傳感器檢測方法的靈敏度一直是分析工作者的研究熱點［12］。利用門控制效應能顯著提高印跡傳感器檢測的靈敏度［14-15］。該法利用模板分子洗脫后，以MIP 上留下的印跡孔穴作為電極與溶液界面上的“門”控制從底液到達電極的探針離子的量。由于底液中的探針濃度高，開啟少量“門”即可使大量探針進入，導致電流急劇增加，產生類似三極管的放大效應。然而，基于擴散電流檢測的伏安分析方法靈敏度仍有待提高。

殼聚糖是自然界唯一的堿性多糖，價格低廉，具有良好的粘附性和成膜特性。目前，利用殼聚糖構建分子印跡傳感器已有較多報道［16-18］，然而這些方法中殼聚糖僅作為印跡膜用于模板分子的識別或僅用于固定功能材料。研究表明殼聚糖分子鏈上分布大量氨基［19-20］，這些氨基在酸性條件下帶正電，能與陰離子以靜電引力結合［21］，并將陰離子或絡陰離子吸附于電極表面［22］，從而產生遠大于擴散電流的吸附電流。據此，本文首次提出了基于殼聚糖修飾層增敏的MIP-門控制效應測量法，并考察了殼聚糖修飾層的增敏效果。通過將殼聚糖修飾至電極，并在其表面電聚合制備倍硫磷的MIP 膜，得到MIP 電化學傳感器。由于殼聚糖能夠通過靜電引力對帶負電的鐵氰酸根陰離子探針產生吸附和富集作用，導致電流信號急劇增加，方法靈敏度顯著提高，可用于環境樣品中痕量倍硫磷的測定。傳感器的制備和檢測原理見圖1。

圖1 殼聚糖增敏的MIP傳感器的制備過程和檢測原理Fig.1 Preparation process and detection principle of chitosan-sensitized MIP sensor

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Autolab PGSTAT128N 工作站（Eco Chemie，Utrecht，瑞士）；CHI660E 電化學工作站（上海辰華儀器有限公司）；三電極體系（武漢高仕睿聯科技有限公司）：鉑絲電極為對電極，Ag/AgCl電極為參比電極，玻碳電極為工作電極；pHS-2C型精密酸度計（上海雷磁精密儀器有限公司）。

倍硫磷和鄰苯二胺購自上海阿拉丁生化科技有限公司；無水乙醇、硝酸、乙酸、鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀、氯化鉀、十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉購自西隴科學股份有限公司。所有試劑均為分析純，實驗用水均為二次蒸餾水（18.2 MΩ·cm）。

1.2 MIP電化學傳感器的制作

將玻碳電極依次使用0.3、0.05μm 氧化鋁粉在麂皮上打磨拋光后，依次用體積比為1∶1 的硝酸、無水乙醇及水將電極洗凈，晾干備用。

取10μL經1%乙酸配制的質量分數為0.16%的殼聚糖溶液，滴涂到電極表面，在60 W的白熾燈下照射干燥20 min，得到殼聚糖修飾的電極。

將殼聚糖修飾的電極放至含50 mg/L倍硫磷和1×10-3mol/L鄰苯二胺的PBS緩沖溶液（0.2 mol/L，pH 7.4）中電聚合制備倍硫磷的MIP膜。電聚合方法為循環伏安法（CV），在0 ～0.8 V電位下掃描20圈，掃描速率為50 mV/s。將聚合MIP膜的電極用水沖洗，自然放干后，放入乙酸-乙醇（1∶8，體積比）洗脫液中緩慢攪拌，將MIP膜上的倍硫磷洗脫后，即制得有倍硫磷印跡孔穴的MIP電化學傳感器。電聚合MIP膜的步驟中不加入倍硫磷，其他實驗條件相同，以此制備非分子印跡（nMIP）電化學傳感器作比較。

1.3 測試方法

電化學測試在5×10-3mol/L 鐵氰化鉀溶液中進行。用CV 和交流阻抗法（EIS）對分子印跡膜進行表征，CV 的掃描電位為-0.2 ～0.6 V，掃描速率為50 mV/s，EIS 的交變電壓為5 mV，頻率范圍為100 mHz ～100 kHz。

樣品測試時，將制備好的電極放入待測液中，重吸附270 s，用水沖洗電極后，轉移至5×10-3mol/L中，吸附富集90 s，用差分脈沖伏安法（DPV）進行電化學信號測試，掃描電位為-0.2 ～0.6 V，振幅為0.05 V。

2 結果與討論

2.1 MIP電化學傳感器的電化學表征

2.1.1 循環伏安法表征以作為探針，對MIP 電化學傳感器進行電化學表征。結果如圖2A 所示，曲線a 表明探針在玻碳電極上有明顯的氧化還原峰，這是因為在電極表面發生了氧化還原反應；將殼聚糖修飾在玻碳電極上（曲線b），由于殼聚糖帶正電，通過靜電作用對陰離子探針進行吸附富集，氧化還原峰明顯增大；當在殼聚糖修飾的電極表面電聚合形成MIP膜后（曲線c），由于電極表面形成了一層致密且導電性差的MIP膜，其氧化還原峰基本消失；對MIP膜上的倍硫磷進行洗脫（曲線d），留下與倍硫磷三維結構相匹配的印跡孔穴，這些印跡孔穴可為探針提供傳遞通道，氧化還原峰明顯增大；但隨著MIP 的重吸附后（曲線e），印跡孔穴對倍硫磷進行識別與吸附，導致傳遞通道堵塞，氧化還原峰減小。由于nMIP膜不存在倍硫磷，洗脫后不會產生倍硫磷的印跡孔穴，因此在聚膜（曲線f）、洗脫（曲線g）和重吸附（曲線h）過程中，氧化還原峰無明顯變化。上述實驗結果表明，MIP膜制備成功，該MIP電化學傳感器對倍硫磷具有特異性識別能力。顯然，門控制效應原理是上述CV法表征的依據。

圖2 分子印跡電化學傳感器的CV（A）及EIS（B）表征Fig.2 CV（A）and EIS（B）characterization of molecularly imprinted electrochemical sensora. bare GCE；b. chitosan-modified GCE；c. electropolymerization MIP；d. after MIP elution；e. after MIP resorption；f. electropolymerization nMIP；g. after nMIP elution；h. after nMIP resorption

2.1.2 交流阻抗表征采用交流阻抗法表征該MIP 電化學傳感器在制備和使用的不同階段時，其電極表面阻抗的變化（見圖2B）。結果顯示，玻碳電極的阻抗很小（曲線a）；修飾殼聚糖后電極的阻抗依然很小（曲線b）；在修飾殼聚糖的電極表面電聚合MIP膜后，由于MIP膜致密且導電性差，阻抗急劇增大（曲線c）；將MIP上的倍硫磷洗脫后，印跡膜上出現印跡孔穴，探針可通過通道到達電極表面，阻抗減小（曲線d）；MIP傳感器上的印跡膜重吸附倍硫磷后，部分印跡孔穴被重新占據，探針的傳遞通道減少，電極表面阻抗增大（曲線e）。該EIS 表征結果與CV 表征結果基本一致，證明對倍硫磷有識別能力的MIP電化學傳感器已成功制備。

2.2 殼聚糖對測量信號的影響

考察了修飾殼聚糖后對MIP電極信號的影響。圖3中a0和b0分別為洗脫后的殼聚糖修飾MIP電極和無殼聚糖MIP 電極在5 × 10-3mol/L Fe溶液中的空白電流曲線，a 和b 分別為吸附50 pg/mL 倍硫磷后的電流曲線。可看出殼聚糖修飾MIP 電極的空白信號明顯高于無殼聚糖修飾MIP 電極；而吸附相同濃度倍硫磷后，殼聚糖修飾MIP 電極的電流變化值ΔIa明顯大于無殼聚糖修飾MIP 電極的ΔIb，前者約為后者的2.6倍。

圖3 殼聚糖的加入對測量信號的影響Fig.3 Effect of chitosan on the measurement signala0 and a were chitosan-modified MIP electrode in blank solution and 50 pg/mL fenthion；b0 and b were the molecularly imprinted sensor without chitosan modification in blank solution and 50 pg/mL fenthion，respectively

2.3 實驗條件的優化

2.3.1 殼聚糖滴涂量的優化考察了殼聚糖滴涂量對電流信號的影響。在2 ～10μL 范圍內，隨著殼聚糖滴涂量的增加，電極表面逐漸形成殼聚糖修飾層，實現對探針的吸附富集，導致電化學信號逐漸增大；而當滴涂量超過10μL時，電流值反而逐漸減小。這是由于殼聚糖修飾層厚度較大時，電極導電性變差，電流反而減小。因此，選擇殼聚糖的最佳滴涂量為10μL。

2.3.2 MIP 膜模板分子洗脫和重吸附時間的優化考察了MIP 的洗脫時間和重吸附時間的影響，結果如圖4所示。隨著洗脫時間的增加，倍硫磷不斷被洗脫，孔穴增多，產生的信號增大，但當洗脫到120 s 時，信號基本不變，表明MIP 電化學傳感器已基本洗脫完成，故選擇最佳洗脫時間為120 s（圖4 曲線a）。在30 ～270 s 內，隨著吸附時間的增加，倍硫磷的吸附量逐漸增加，導致印跡孔穴被堵塞，探針的電信號減少；當吸附時間達270 s 時，吸附達到飽和，電流值保持不變。因此，選擇270 s為最佳重吸附時間。

圖4 洗脫時間（a）及重吸附時間（b）的優化Fig.4 Optimization of elution time（a）and resorption time（b）

2.3.3 探針吸附富集時間的優化殼聚糖在靜電作用下對陰離子探針進行吸附富集。因此，考察了探針的吸附富集時間對電流信號的影響。結果表明，在0 ～90 s 內，隨著吸附時間不斷增加，電流信號不斷變大；當吸附時間超過90 s時，電流信號趨于平穩，表明殼聚糖對探針已吸附飽和。因此，選擇最佳吸附時間為90 s。

2.4 MIP電化學傳感器的分析性能

在最佳實驗條件下，將制備好的MIP電化學傳感器置于不同濃度的倍硫磷標準溶液中進行重吸附270 s，放入Fe（CN）4-6/Fe（CN）3-6中對探針進行吸附富集90 s，然后用DPV 法記錄電流值，結果如圖5所示。隨著倍硫磷質量濃度的增大，電流信號逐漸減小，表明MIP對倍硫磷的吸附量不斷增加。其中，電流變化值（ΔI）與倍硫磷濃度在1 ～10000 pg/mL范圍內呈良好線性關系，線性方程為ΔI=23.09logC（pg/mL）+12.65，線性相關系數r2=0.9981。根據檢出限（DL）=3δb/K計算得到DL為0.35 pg/mL。與其他倍硫磷檢測方法相比，本方法具有更低檢出限（表1）。

圖5 重吸附不同濃度倍硫磷溶液后的DPV響應曲線及校準曲線Fig.5 DPV response curves and calibration curve after resorption of different concentrations of fenthion fenthion concentration（a-m）：0，1，2.5，5，25，50，100，250，500，1000，2500，5000，10000 pg/mL

表1 不同倍硫磷檢測方法的性能比較Table 1 Performance comparison of different methods for the detection of fenthion

2.5 MIP電化學傳感器的選擇性

為了驗證分子印跡電化學傳感器的特異性識別能力，考察了質量濃度為50 ng/mL（100 倍）的草甘膦、氟樂林、氟蟲腈、甲基對硫磷、殺草強、西維因等農藥對測定500 pg/mL倍硫磷的影響。將制備的傳感器分別放入上述干擾物中進行重吸附后，進行電信號的檢測（圖6）。結果顯示，這些農藥對倍硫磷的干擾較小，表明該傳感器具有良好的選擇性。

圖6 MIP電化學傳感器的選擇性Fig.6 Selectivity of MIP electrochemical sensor

2.6 傳感器的重現性與穩定性

在相同條件下制備5個傳感器，對質量濃度為500 pg/mL 倍硫磷的信號變化進行考察，5 支電極的電流值的相對標準偏差為2.4%，說明該傳感器的重現性良好。

將制備好的MIP電極置于5 ℃冰箱中保存不同時間后對500 pg/mL 倍硫磷溶液進行測定，結果表明，放置3 d 后對倍硫磷的響應值減小1.1%，7 d后減小3.6%，15 d 后僅減小5.9%。說明該傳感器具有良好的穩定性。

2.7 實際樣品的檢測

為考察該MIP 電化學傳感器實際應用的可行性，對蔬菜水果中的倍硫磷進行檢測。稱取來源于農貿市場的蔬菜水果各10 g，剪碎，加入10 mL乙腈作為提取劑，經超聲、離心后，取上清液，放進5 ℃冰箱待用。將制備好的MIP 電化學傳感器置于待測液中重吸附270 s 后，放入Fe（CN）4-6/Fe（CN）3-6中吸附富集90 s，再測量DPV 電流信號。采用標準加入法對傳感器的實際性能進行分析，結果見表2。分析結果的加標回收率為99.0%～109%，相對標準偏差（RSD）為1.9%～2.9%。表明該傳感器在實際檢測中具有較好的檢測效果。

表2 蔬菜水果樣品中倍硫磷的檢測及加標回收率Table 2 Detection and recovery of fenthion in vegetable and fruit samples

3 結論

本文研制了殼聚糖修飾的倍硫磷分子印跡電化學傳感器，利用殼聚糖對探針陰離子的富集作用，提高分子印跡傳感器檢測的靈敏度。該傳感器對倍硫磷的測定檢出限達0.35 pg/mL，已應用于蔬菜水果樣品中倍硫磷的測定。本方法靈敏度高、選擇性好、操作簡單、穩定性好。這種利用殼聚糖對探針陰離子的富集作用提高靈敏度的檢測方法為研制其它分子印跡傳感器提供了有益的借鑒。