基于UPLC-Q-TOF MS技術結合化學計量學數據自動化解析的不同花期沙棗花成分分析

張佳妮，都青鈺，汪興財，劉嘉楠，馬夢晗，馬興玲，趙娟娟，郭曉萌，張 陽，于永杰*

（1.寧夏醫科大學 藥學院，寧夏 銀川 750004；2.浙江工業大學 化學工程學院，浙江 杭州 310032）

沙棗花為胡頹子科胡頹子屬植物沙棗（Elaeagnus angustifoliaL.）的花朵，主要分布于我國西北地區如寧夏、甘肅、青海、新疆等地。沙棗花形似漏斗、銀白色、小而香［1］，開花時間隨不同地區的海拔高度和氣候條件而有所差異，但多集中于5 ～6 月份，花期約20 余天。沙棗花作為藥食同源的植物，具有廣泛的生物活性和應用價值［2］。沙棗花味甘、澀，性溫，止咳平喘。沙棗花蜜可供氣虛畏寒、脾胃虛寒的病人食用。沙棗花精油可用于化妝品行業［3］，也可作為原輔料添加在加工食品中，如沙棗花茶、沙棗花調味酒等。不同花期沙棗花的化學成分含量分布有所不同，并會影響沙棗花的品質，因此研究沙棗花花期中的化學成分變化對于產品原料的保障具有實際價值。

目前，國內外已針對沙棗花的化學成分開展了研究，如王雅等［4］對沙棗花開花周期中精油的含量和質量進行評估，發現沙棗花精油在不同開花周期中具有規律性，精油含量在開花率為80%時達到峰值。喬海軍等［3］對沙棗花的揮發油進行了氣相色譜-質譜（GC-MS）分析，分離出64 個組分并鑒定了54個組分，其中含量最高的化合物為反式肉桂酸乙酯。丁嘉文等［5］通過水蒸氣蒸餾法、固相微萃取法、頂空采集法、氣囊采集法4 種方法對沙棗花中的揮發性成分進行提取，采用GC-MS 進行成分鑒定，發現4種方法均可提取出反式肉桂酸乙酯和鄰苯二甲酸二乙酯。Torbati等［6］應用GC-MS和氣相色譜-火焰離子化檢測器（GC-FID）聯用技術，對沙棗花中提取的揮發油進行化學成分分析，最終鑒定出53個成分，占精油總含量的96.59%。

當前針對沙棗花中化學成分的研究多集中于揮發性成分，側重于利用GC-MS開展沙棗花精油的相關研究，而有關沙棗花的超高效液相色譜-串聯飛行時間質譜（UPLC-Q-TOF MS）分析研究鮮有報道。液相色譜-質譜聯用技術作為代謝組學研究的主要平臺［7-8］，能夠實現沙棗花中難揮發性化合物更準確且穩定的檢測。但當前高分辨質譜信息的解析存在多種難題，如化合物提取困難、化合物鑒定錯誤和難以篩選差異性化合物等。為解決這一問題，本課題組提出了超高效液相色譜-高分辨質譜（UPLC-HRMS）數據自動化分析處理軟件AntDAS［9-10］，根據化合物離子分布特點，采用離子密度聚類方法實現數據中提取離子色譜（EIC）峰的構建。隨后采用動態窗口拓展結合儀器噪聲自動估計策略實現EIC峰的提取，并標記精確m/z值。待樣本中所有EIC峰提取后，根據EIC峰的高精度m/z值進行注釋，識別［M+H］+、［M+Na］+、［M-H2O+H］+等。AntDAS在多樣本分析時能夠根據色譜峰保留時間進行注冊，支持統計分析如方差分析（ANOVA）、化學計量學方法如主成分分析（PCA）、偏最小二乘判別分析（PLS-DA）、層次聚類分析（HCA）等，并對篩選的差異性化合物進行鑒別，可為不同花期沙棗花中化學成分的變化研究提供新的分析工具。

本研究以寧夏地區不同花期沙棗花為研究對象，通過液質聯用與非靶向代謝組學技術結合課題組發展的AntDAS平臺對不同花期沙棗花中的差異性代謝物進行分析，并采用主成分分析和層次聚類分析對不同花期的沙棗花樣本進行了判別分析，以期為供應品質穩定的沙棗花工業原料提供科學依據。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITY UPLC I-Class PLUS超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Triple TOF 5600+質譜儀（美國AB SCIEX 公司）；ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm × 100 mm，1.7 μm，美國Waters 公司）；氮氣發生儀（英國PEAK 公司）；真空泵（德國Leybold公司）；KQ-250B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；渦旋儀（杭州旌斐儀器科技有限公司）；離心機、-40 ℃冰箱（賽默飛世爾科技（中國）有限公司）；電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；真空冷凍干燥機（上海葉拓科技有限公司）；高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）。

甲醇、乙腈、異丙醇（色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司）；甲酸（德國Merck 公司）；蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）；對照品：苯丙氨酸、谷氨酰胺、L-蛋氨酸、L-賴氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸、L-組氨酸購自美國Sigma 公司，N-甲基-L-脯氨酸、對羥基肉桂酸、水仙苷、反式阿魏酸、苦豆堿購自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 樣品采集

沙棗花樣本采集于寧夏回族自治區銀川市興慶區小雁湖旁（北緯38°24'40″，東經106°16'24″）。采摘時間為2021 年5 月16 日至6 月2 日，平均間隔4 ～5 d 采集1 次，包括初花期G1（少量花開放至全樹25%花瓣開放）、盛花始期G2（全樹70%～80%花瓣開放）、盛花期G3（100%花瓣開放）以及盛花末期G4（花瓣蔫萎脫落）的樣本。每個花期采集8 個平行樣本，共采集32 個沙棗花樣本。樣本采摘后進行液氮速凍，轉移至-40 ℃冰箱冷凍保存，直至樣本分析。

1.3 沙棗花中化合物的提取

將沙棗花樣本置于真空冷凍干燥機中凍干24 h 后取出粉碎。稱取沙棗花樣品20 mg 于2 mL 離心管中，加入1.5 mL 70%甲醇-水提取溶劑，渦旋2 min，超聲提取30 min，13000 r/min 下離心15 min后，取上清液裝入色譜瓶待分析。

質控（QC）樣本由所有沙棗花凍干粉末等量混勻制得，其化合物提取與上述步驟相同。

1.4 UPLC-Q-TOF MS儀器條件

液相色譜條件：進樣量：3μL；流速：0.2 mL/min；柱溫：35 ℃；流動相A 為0.1%甲酸-水，B為0.1%甲酸-乙腈。梯度洗脫程序：0 ～1 min，95% ～85% A；1 ～7 min，85% ～80% A；7 ～13 min，80% ～75% A；13 ～19 min，75% ～65% A；19 ～27 min，65% ～42% A；27 ～32 min，42% ～25% A；32 ～35 min，25%～15% A；35 ～36 min，15%～0%A；36 ～39 min，0% A；39 ～40 min，0%～95% A。后運行5 min。

質譜條件：使用數據采集軟件（Analyst TF 1.8 Software）設置在信息依賴采集（IDA）模式下采集樣品的高分辨質譜信息。離子源采用電噴霧電離源（ESI），正離子模式下采集，霧化氣（GS1）：344750 Pa（50 psi）；輔助加熱氣（GS2）：344750 Pa（50 psi）；氣簾氣（CUR）：117215 Pa（17 psi）；離子源溫度：500 ℃；霧化電壓（ISVF）：5500 V；去簇電壓（DP）：80 V。

正離子模式下設置一級質譜質量掃描范圍為100 ～1000 Da，碰撞能量（CE）為10 eV，一級采集頻率（Accumulation time）為0.2 s。IDA模式下自動選取離子采集二級質譜信息，二級質譜質量掃描范圍為50 ～1000 Da，碰撞能量擴展（CES）：15 eV，質量允差（Mass tolerance）為100 mDa，采集頻率為0.03 s，每個循環監測的候選離子最多選擇5個母離子掃描二級質譜信息，動態排除時間為5 s。

1.5 數據處理

數據分析由課題組研發的AntDAS數據處理軟件完成。該軟件能直接對儀器采集的原始數據進行分析，包括自動實現EIC峰構建、EIC峰提取、峰注釋、樣本時間漂移校正、峰注冊和峰填充等，可獲得樣本×EIC 峰的化合物信息列表。基于該列表進行化學計量學分析，如方差分析、層次聚類分析和主成分分析，最終將篩查出的化合物質譜譜圖與第三方數據庫（http：//prime.psc.riken.jp/compms/msdial/main.htmL）進行匹配鑒定。

2 結果與討論

2.1 AntDAS實現沙棗花中化合物信息的提取

AntDAS 能 夠 直 接 讀 取UPLC-HRMS 的原始數據，圖1為沙棗花QC樣本的總離子流色譜（TIC）圖，由圖可見TIC峰在整個流出段內基本得到良好分離。利用AntDAS 能夠自動實現儀器采集的原始數據分析，圖2A給出了AntDAS 中m/z133.1012 Da 下色譜峰的提取結果，共提出17 個EIC 峰，多數EIC 峰實現了基線分離。圖2B 和圖2C 給出了峰提取結果的局部放大圖，表明即使借助于高分辨質譜技術，仍存在部分化合物信號重疊的情況。針對化合物的重疊信號，AntDAS能夠實現較為合理的分割。從圖2C可以看出，AntDAS能夠從儀器背景噪聲中準確識別化合物的EIC峰，并準確估計化合物的流出范圍。利用AntDAS 對39 個樣本進行分析，最終得到19478×39 的化合物信息列表，其中19478為EIC峰數量，39為樣本數量（包括32個不同花期的沙棗花樣本與7個QC樣本）。

圖1 沙棗花QC樣本的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of QC sample of Elaeagnus angustifolia L. flowers

圖2 AntDAS進行EIC峰提取（A）及其細節圖示例（B、C）Fig.2 EIC peak extraction with AntDAS（A）and its detail diagram（B，C）

對樣本中7 個QC 樣本進行評估，計算各EIC 峰面積的相對標準偏差（RSD），結果如圖3 所示。由圖可知，RSD ≤20% 的色譜峰數量為11267 個，占總峰數量的57.8%。RSD ≤30%的色譜峰數量為12998個，占總峰數量的66.7%。即使在RSD ≤10%的水平下，峰數量仍達到總峰數量的33.1%，說明該方法在批量進樣過程中穩定，所采集的數據質量可靠，可以進行后續研究。

圖3 基于QC樣本的色譜峰面積RSD分布圖Fig.3 RSD distribution map of chromatographic peak area based on QC samples

2.2 不同花期沙棗花樣本分析

利用ANOVA 對注冊的化合物EIC 峰進行分析，在P值為0.01 置信水平下，篩選出13664 個在不同組別間存在差異的EIC 峰。隨后基于差異性EIC 峰進行PCA 和HCA 分析，結果如圖4A 和圖4B 所示。PCA 分析結果表明，前兩個主成分解釋了樣本中約60%的信息（圖4A）。樣本在前兩個主成分上的分布清晰地顯示出不同花期的沙棗花樣本分別聚成一類。不同花期的樣本在前兩個主成分上的分布距離存在明顯不同，沿第一主成分軸逐步變化，體現了不同花期沙棗花中的化合物不斷變化。從PCA 圖中還可看出QC 樣本位于前兩個主成分軸的原點，表明樣本混合均勻。且QC 樣本聚集較為緊密，表明本方法的精密度較好。HCA 分析表明，不同花期的沙棗花樣本聚為4類（圖4B）。其中初花期和盛花始期較為接近，而盛花期和盛花末期較為接近，與PCA分析結果相一致。

圖4 不同花期沙棗花樣本的PCA（A）和HCA（B）分析結果Fig.4 PCA（A）and HCA（B）analysis results of flower samples of Elaeagnus angustifolia L. in different flowering stagesG1：initial bloom stage（初花期）；G2：pre-full bloom stage（盛花始期）；G3：full bloom stage（盛花期）；G4：ending of the bloom stage（盛花末期）

2.3 化合物鑒定

AntDAS能夠自動根據EIC峰的峰形和MS/MS結果將同一化合物的峰劃分到一起，同時整合多樣本的信息構建化合物離子源內裂解形成的MS 及MS/MS 譜圖，用于化合物的識別。以槲皮素-3，4'-二-Oβ-葡萄糖苷為例，圖5展示了基于AntDAS 的化合物識別流程。圖5A 為AntDAS 構建的化合物MS 譜圖，由化合物源內裂解形成的碎片離子構成。圖5B 為對應各碎片離子的EIC 圖，流出曲線的形狀高度一致。圖5C為m/z627.15的MS/MS譜圖，該離子斷裂后主要形成m/z465.1125和303.0489的碎片離子，與圖5A中MS的離子一致，表明AntDAS能夠從復雜數據中準確構建化合物的MS和MS/MS譜圖。圖5D為化合物最終的鑒定結果，該物質的MS 和MS/MS 譜圖匹配較好。利用AntDAS 構建的MS 和MS/MS 譜圖對化合物進行識別，最終鑒定出沙棗花中19 個化合物（見表1）。同時對鑒定的化合物進行對照品驗證，最終能明確12個化合物。

表1 利用AntDAS構建的MS和MS/MS化合物識別結果Table 1 The results of compound identified through MS and MS/MS constructed by AntDAS

圖5 AntDAS的化合物鑒定過程示例Fig.5 An example of the compound identification process by AntDASA：MS spectrum of compound constructed by AntDAS；B：EICs corresponding to each fragment ions；C：MS/MS spectrum of m/z 627.15；D：final result of compound identification

圖6 給出了19 個化合物的熱圖分析結果。由圖可知，不同花期沙棗花中化合物的含量分布有明顯差異，初花期中氨來呫諾、對羥基肉桂酸、苯丙氨酸、4-羥基肉桂醛的含量相對較高。盛花始期中，氨來呫諾、5-羥基色胺、谷氨酰胺、山奈酚-3-O-葡萄糖苷-6″-p-香豆酰、L-蛋氨酸、L-酪氨酸6 個化合物的含量較高。盛花期中，N-甲基-L-脯氨酸、水仙苷、反式阿魏酸、5-羥基色胺、谷氨酰胺、L-蛋氨酸、L-酪氨酸、L-組氨酸、L-賴氨酸、L-色氨酸等化合物的含量相對較高。盛花末期中，槲皮素-3，4'-二-O-β-葡萄糖苷、5-羥基色胺、矮牽牛素-3-O-β-葡萄糖苷、L-蛋氨酸、L-酪氨酸、L-組氨酸、L-賴氨酸、L-色氨酸、香橙素9個化合物的含量較高。

圖6 AntDAS鑒定出的沙棗花中化合物的熱圖分析結果Fig.6 The heatmap analysis results of compounds in Elaeagnus angustifolia L. flowers identified by AntDAS compound numbers were the same as those in Table 1

熱圖分析結果顯示，沙棗花中多數氨基酸在盛花期和盛花末期中含量較高。現有研究表明，氨基酸與植物進行光合作用、抗病蟲害、調節植物生長有關。同時氨基酸還可作為衡量植物品質的重要指標［11］，其組成和含量影響植物的化學成分，例如茶葉中的氨基酸調控其香氣和滋味［12］，煙草中的氨基酸對其香氣有重要貢獻，影響卷煙品質［13］，由此推測沙棗花的特殊香味也與其種類豐富的氨基酸有關。此外，沙棗花中鑒定出以下化合物，如香橙素具有清除氧自由基、抗病毒等作用［14］；反式阿魏酸具有抗炎、止痛、抗血栓、抗自由基和調節免疫功能等作用；苦豆堿具有抗腫瘤、抗蟲和抗炎等作用；水仙苷具有抗炎和殺蟲等作用［15］，其在盛花期的沙棗花中含量相對較高。而初花期和盛花始期的沙棗花中氨來呫諾含量相對較高，該化合物已在臨床上用于治療哮喘、過敏性鼻炎和復發性口腔潰瘍［16］，這與沙棗花的功能主治相似，提示用于止咳平喘的沙棗花應在花期相對靠前的時間采集。

以上分析表明，基于本課題組自主開發的AntDAS 結合UPLC-Q-TOF MS 技術能實現不同花期沙棗花中差異性化合物的篩查和鑒定，可用于沙棗花開花期間的化合物含量變化研究。本研究不僅對沙棗花的品質穩定性評估以及后期開發應用提供了理論支撐，同時為復雜植物中化學成分分析提供了新的技術手段。

3 結論

本文提出了將AntDAS與UPLC-Q-TOF MS非靶向代謝組學技術相結合的策略用于研究不同花期沙棗花中差異性代謝物的變化。借助該策略篩選出19個化合物，其中12個化合物經對照品驗證一致，多數氨基酸在沙棗花的盛花期和盛花末期中含量更高，槲皮素-3，4'-二-O-β-葡萄糖苷、香橙素等黃酮類化合物在盛花末期中含量更高，在其它生長時期含量偏低。本研究不僅為不同花期沙棗花的化學成分分析以及開發應用提供依據，同時表明AntDAS可為其他植物體系不同采收時期樣本的評估提供新的手段。