特色農產品蘭州百合產地溯源及確證

李善家 ，崔莉娟，蘇培璽，王 輝，王福祥，王子濠

（1.蘭州理工大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州 730050；2.中國科學院西北生態環境資源研究院，甘肅蘭州 730000）

農產品產地溯源主要是檢測其化學成分和生物組成，如紅外光譜溯源技術和高效液相色譜溯源技術，然而用于產地溯源的化學成分受產品成熟度、加工方式、儲藏條件影響造成損失，導致有效信息丟失，影響產地判別的準確性[1]；拉曼光譜溯源技術引用新物質對被測體造成某種程度的污染而導致一定的誤差；DNA 指紋圖譜和SSRs 標記技術因操作難度大、耗費成本高而限制其普及，且DNA 是物種的特有屬性，不會因環境的變化而改變，在地理溯源中有限制[2]?；谕凰刈匀环逐s效應的穩定同位素溯源技術，因機體內碳、氮、氧等同位素組成受氣候、環境、代謝類型等因素影響，其豐度呈現顯著的地域特征，是追溯農產品地理來源和確證的有力工具[3-4]。礦質元素技術因農產品礦質元素含量受土壤類型、水、氣候、人類活動等影響存在差異性和獨特性，其特征性礦質元素可以作為農產品重要的產地溯源指標[5]。

蘭州百合（LiLum davidivarunicdor）是百合科（Liliaceae）百合屬（Lilium）多年生草本植物，屬于“川百合”變種，以其食用性聞名，是國家地理標志農產品。栽培種植區域主要集中在蘭州市七里河區、西固區、榆中縣及周邊臨洮縣等地。蘭州百合色澤潔白如玉、肉質肥厚細膩、纖維少、味微甜；食療具有止咳平喘、改善睡眠、預防老年癡呆等功效[6]；藥用具有清熱解毒、滋陰潤肺、清心安神之功效，其鱗莖含有多糖、黃酮類、多酚類等生物活性物質，具有抗氧化、抗腫瘤、增強免疫等功能[7-8]。市場上蘭州百合具有較高的經濟價值，有不法商家產地造假、以次充好，致使質量安全問題頻發，對消費者權益造成一定的威脅。穩定同位素和礦質元素指紋技術聯合已被應用于豆類[9]、水稻[10]、茶葉[11]等的產地溯源，對準確判別其原產地提供了技術支撐，但有關蘭州市百合產地溯源的相關研究尚未見報道。利用穩定同位素和礦質元素指紋技術聯合研究蘭州百合的地域和來源差異，借助生態化學計量學與數理統計學的方法篩選產地溯源典型有效指標，建立和評價判別模型和數據庫，實現百合溯源與確證，對地理標志產品蘭州百合的品牌保護和產業發展具有重要意義和應用價值。

本研究針對蘭州百合核心主產區的18 個供試樣本，利用穩定同位素和礦質元素指紋技術聯合開展蘭州百合的溯源研究，同位素比率質譜（Isotope Ratio Mass Spectrometry，IRMS）測定δ13C、δ15N、δ18O 等3 種穩定同位素比率，電感耦合等離子體質譜（Inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）測定K、Mg、Ca、Na、B、Fe、Zn、Al、Mn、Cu、Mo、Cr、Cd、Se、As、Pb 等16 種礦質元素含量；結合主成分分析（Principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘法分析（Orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）和線性判別分析（Linear discriminant analysis，LDA），對不同產區蘭州百合構建分類模型，驗證判別溯源確證；以期為主產區蘭州百合質量控制、產地溯源、食品安全等方面提供科學理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘭州百合（LiLum davidi var unicdor）于2018年10 月收獲季節采集于核心主產區蘭州市七里河區黃峪鎮、西果園鎮、中鋪鎮和阿甘鎮等，共收集18 個不同地理來源的樣本，并使用手持全球定位系統記錄每個采樣點的經度、緯度和海拔，國家環境信息中心獲取并計算得到年均氣溫、年降水量和相對濕度見表1。

表1 蘭州百合主產區采樣點環境信息Table 1 Environmental information of sampling sites in the main producing area of Lanzhou lily

253 Plus 型氣體穩定同位素質譜儀、Delta Plus XP 型穩定同位素質譜計、Flash EA 型元素分析儀、Element XR 型電感耦合等離子體質譜儀 美國賽默飛世爾公司；微波消解儀器 美國CEM 公司；Millipore 超純水系統 美國密理博公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理 百合樣品置于恒溫烘干箱70 ℃烘干至恒重，植物粉碎機粉碎樣品，經充分研磨后過100 目篩，收集備用。

1.2.2 穩定同位素δ13C 和δ15N 測定 稱取5 mg 百合粉末裝入錫囊。使用同位素比率質譜儀和元素分析儀（Flash EA）進行δ13C 和δ15N 的分析。樣品經自動進樣器進入元素分析儀（Flash EA），高溫燃燒產生CO2和N2，在工作載氣氦氣的載帶下流經吸附柱分離純化后進入同位素比率質譜儀測定δ13C 和δ15N。分析條件：吹掃氣流180 mL/min，氧化爐溫度1020 ℃，還原爐溫度680 ℃，載氣流速90～100 mL/min。IAEA-600：δ13CV-PDB=-27.77‰±0.2‰，USGS24：δ13CV-PDB=-16.09 ‰±0.2 ‰ ；IAEA-N-2：δ15NAir=20.30‰±0.2‰，IAEA-NO-3：δ15NAir=4.70‰±0.2‰為標樣對儀器進行校正。樣品一式三份進行分析，并取其平均值。

1.2.3 穩定同位素δ18O 測定 稱取1 mg 樣品裝入銀囊，用同位素比率質譜儀和元素分析儀（Flash EA）對δ18O 進行分析。樣品中氧元素在高溫裂解爐中裂解釋放后與玻璃碳瞬間反應生成CO，被高純氦氣攜載經過色譜柱進入同位素比率質譜儀測定δ18O。分析條件：爐溫1380 ℃，載氣流速150 mL/min，吹掃氣流200 mL/min，色譜柱溫50 ℃。IAEA-601：δ18OV-SMOW=23.14‰±0.2‰和IAEA-CH-6：δ18OV-SMOW=36.40‰±0.2‰為標樣對儀器進行校正。樣品一式三份進行分析，并取其平均值。

1.2.4 礦質元素含量測定 稱量0.10 g 百合樣品放入聚四氟乙烯消解容器中，依次加入5 mL 60%硝酸和1 mL 30%過氧化氫進行消解。消化后的溶液在電熱儀180 ℃條件下去除多余酸溶液至1 mL，超純水定容至10 mL，即為待測元素供試溶液。由電感耦合等離子體質譜儀測定16 種礦質元素（K、Mg、Ca、Na、B、Fe、Zn、Al、Mn、Cu、Mo、Cr、As、Se、Cd、Pb）含量。分析條件：射頻功率1550 W，霧化室溫度2 ℃，采樣深度10 mm，等離子體流量15 L/min，載氣流量1.0 L/min，輔助器流量0.45 L/min，采集點數3 次，重復次數3 次。

1.3 數據處理

農產品產地溯源主要分析表征不同地域來源農產品的特異性指標。PCA、OPLS-DA 和LDA 等多元數理統計分析技術可以有效實現多個地域特征指標的綜合分析，建立起能夠區分農產品產地來源的特征指紋圖譜。PCA 是對原有數據降維，揭示數據群的主要影響因子，并對具有代表性的主成分數據進行可視化的多元統計分析方法[12-13]。OPLS-DA 是一種適用于樣本量小和自變量較少的有監督的判別方法，可以解決多變量共線性問題，排除干擾數據，提高模型的解釋性和預測的可靠性[14]。R2和Q2用來評價OPLS-DA 模型的擬合程度和預測能力，R2和Q2均＞0.5 時，模型有較好的預測性[15]。變量投影重要度（Variable importance for the projection，VIP）是OPLS-DA 模型中評價變量重要性常用參數，VIP 值可以量化每個變量對分類的貢獻，VIP 越大（VIP＞1），對地域判別的差異性越顯著[16]。LDA 也是一種有監督的線性降維分析方法，其通過低維向量空間中最大化類間距離和最小化類內距離，保證不同類中的變量盡可能分離[17]。采用SPSS 20.0 統計分析軟件進行單因素方差分析（One-Way ANOVA）和LDA 分析，SIMCA-P 14.1 軟件進行PCA 和OPLS-DA 分析。

2 結果與分析

2.1 蘭州百合穩定同位素和礦質元素含量的變異特征和地區差異

黃峪鎮、西果園鎮、中鋪鎮和阿甘鎮4 個產區蘭州百合的δ13C、δ15N、δ18O 等3 種穩定同位素和K、Mg、Ca、Na、B、Fe、Zn、Al、Mn、Cu、Mo、Cr、As、Se、Cd、Pb 等16 種礦質元素數據的平均值、極大值、極小值、標準誤、標準差、變異系數等基本統計見表2，δ13C 值變幅為-25.22‰～-24.13‰，δ15N 值變幅為-3.06‰～6.48‰，δ18O 值變幅為26.00‰～30.47‰。礦質元素含量變幅為0.36 μg/kg（Pb）～13.55 g/kg（K），其中K 元素含量介于4.78～13.55 g/kg 之間，Pb 元素含量介于0.36～24.74 μg/kg 之間。通常認為變異系數≤0.1 為弱變異，0.1～1 之間為中等變異，變異系數≥1 為強變異，穩定同位素δ15N 變異系數為3.07，屬于強變異；所測的16 種礦質元素變異系數介于0.12～0.88 之間，屬于中等變異強度，其中Mo 元素的變異系數最大，為0.88。4 個產區元素含量的平均值和標準誤差及多重比較如表3 所示，單因素方差分析結果顯示δ13C、δ15N、K、Mg、Na、B、Fe、Mn、Cu、Mo、Cr、Cd 差異顯著（P＜0.05），Duncan 多重比較表明，黃峪鎮和阿甘鎮的樣本δ13C 差異不顯著（P＞0.05），但均顯著（P＜0.05）高于西果園鎮，δ15N 在黃峪鎮、西果園鎮和阿甘鎮3 個產地間差異不顯著（P＞0.05），但顯著（P＜0.05）高于中鋪鎮；B 在西果園鎮、阿甘鎮、中鋪鎮3 個產地間均差異顯著（P＜0.05），且西果園鎮＞阿甘鎮＞中鋪鎮，黃峪鎮Cu、Cd 顯著（P＜0.05）高于西果園鎮，西果園鎮K、Mg、Fe、Mn 顯著（P＜0.05）高于中鋪鎮，中鋪鎮Cu、Mo、Cd 顯著（P＜0.05）高于西果園鎮，阿甘鎮Na、Mn、Cr 顯著（P＜0.05）高于中鋪鎮。

表2 蘭州百合穩定同位素和礦質元素含量的變異特征Table 2 Variation characteristics of stable isotope and mineral element contents of Lanzhou lily

表3 主產區穩定同位素和礦質元素含量特征Table 3 Characteristics of stable isotope and mineral element contents in main producing areas

2.2 蘭州百合主產區產地溯源的PCA 分析

對蘭州百合δ13C、δ15N、K、Mg、Na、B、Fe、Mn、Cu、Mo、Cr、Cd 進行PCA 分析。如表4 所示，基于特征值＞1 原則的前5 個主成分方差貢獻率分別為36.88%、16.51%、11.06%、10.38%、9.54%，總方差貢獻率84.36%，即前5 個主成分因子模型解釋了84.36%的原數據，代表原始變量84.36%的信息。利用PCA 前兩個主成分因子得分作X 軸、Y 軸繪制得分圖，圖1a 所示，蘭州百合分為4 類，其中黃峪鎮和中鋪鎮集中在第一主成分的正象限，西果園鎮集中在第一主成分的負象限，阿甘鎮數據間距離較大，聚類效果低于其它3 個產區。選擇前兩個主成分因子載荷值繪制載荷圖，圖1b 所示，第一軸K、Mg、B、Fe、Mn、Cu、Mo、Cd 載荷值較高，第二軸δ13C、δ15N、Cd、K、Mg、Cu 載荷值較高。δ13C、Cu、Mo與第一主成分顯著（P＜0.05）正相關，δ15N、K、Mg、Na、B、Fe、Mn、Cr、Cd 與第一主成分顯著（P＜0.05）負相關；結果表明，蘭州百合穩定同位素和礦質元素作為其產地識別指標可行，δ13C、δ15N、K、Mg、Na、B、Fe、Mn、Cu、Mo、Cr、Cd 等變量可作為PCA 分析重要因子。

圖1 PCA 前兩個主成分因子得分圖（a）和載荷圖（b）Fig.1 Score plot (a) and load plot (b) of PCA along the two principal components axes

表4 蘭州百合穩定同位素和礦質元素含量的主成分分析Table 4 Principal component analysis of stable isotope and mineral element contents of Lanzhou lily

2.3 主產區蘭州百合產地溯源的OPLS-DA 判別分析

為排除干擾信息，進一步尋找蘭州百合產區產生差異的主要標志物，進行OPLS-DA 判別分析，以δ13C、δ15N、K、Mg、Na、B、Fe、Mn、Cu、Mo、Cr、Cd 為變量，構建的模型穩定可靠，其中R2X=0.63，R2Y=0.80，Q2=0.59，＞0.5。OPLS-DA 前兩個主成分因子得分圖見圖2a，蘭州百合樣本各自聚為一類，明顯區分為4 類，各部分間相互分離，表明4 個主產區蘭州百合在OPLS-DA 模型中分類效果較好。VIP值見圖2b，以VIP＞1 為標準，得到5 個差異標志物，即Na、δ15N、Cr、Cd、δ13C。說明Na、δ15N、Cr、Cd、δ13C 對區分不同產區百合的貢獻較大，對構建模型的解釋性和蘭州百合的產地判別具有重要意義。對蘭州百合樣本進行內部驗證，采用七折交叉驗證和留一法交叉驗證對其驗證見表5，兩種驗證方法下4 個主產區判別正確率均為100%，說明OPLS-DA 模型適用蘭州百合產地判別。

圖2 OPLS-DA 前兩個主成分因子得分圖（a）和VIP 圖（b）Fig.2 Score plot (a) and VIP plot (b) of OPLS-DA along the two principal components axes

表5 OPLS-DA 對蘭州百合4 個主產區產地溯源的驗證判別Table 5 Verification and discriminant of OPLS-DA for geographical origin traceability of the four main producing areas of Lanzhou lily

2.4 蘭州百合主產區產地溯源LDA 判別分析

LDA 分析篩選確定δ13C、δ15N、Na、B、Cu、Cd、Cr 作為重要變量構建模型，根據Wilks 'lambda 值共擬合3 個判別函數，F1、F2、F3分別解釋了總方差的60.8%、30.0%、9.2%。典型相關系數分別為：1.36、1.99、0.19，基于δ13C、δ15N、Na、B、Cu、Cd、Cr 建立的蘭州百合判別函數如下：

通過繪制F1和F2檢查判別空間中百合樣品地理來源之間的距離，對其進行分類，如圖3 所示，4 個產區蘭州百合樣品可以區分，但黃峪鎮和中鋪鎮距離較近。將δ13C、δ15N、Na、B、Cu、Cd、Cr 作為判別指標，采用留一法交叉驗證法對LDA 模型進行驗證，結果見表6，對已知18 份樣本的原始判別正確率為100%，留一法交叉驗證正確率為88.89%，因此，δ13C、δ15N、Na、B、Cu、Cd、Cr 作為4 個產區的判別指標對其進行產地確證可行。4 個產區的Fisher 線性判別式函數如下：

圖3 基于LDA 前兩個主成分構建的蘭州百合樣品散點圖Fig.3 Scatter plot of Lanzhou lily samples based on the first two principal components of LDA

表6 LDA 對蘭州百合4 個主產區產地溯源的驗證判別Table 6 Verification and discriminant of LDA for geographical origin traceability of the four main producing areas of Lanzhou lily

3 討論

近年來，特色農產品、地理標志農產品備受關注，農產品品牌已經成為進入國內外市場的“流通名片”，在農業轉型收益、農民增收等方面發揮重要作用。蘭州百合極具蘭州地方特色，是公認的品質優良的蔬菜和藥材，于2004 年被列為地理標志產品。產地是蘭州百合形成的一個重要原因。盲目引種、擴繁栽培可能導致其質量下降，生產銷售等環節存在的以次充好、品質優劣層次不齊，增加了蘭州百合安全事故發生的風險，不僅影響了蘭州百合在國內外的市場需求和出口，而且威脅到消費者對于蘭州百合安全食用的安全性。因此，加強從“農田到餐桌”的跟蹤系統或從“餐桌到農田”的源頭可追溯系統成為其質量保證的關鍵，且迫切需要建立蘭州百合一種有效的可追溯方法。穩定同位素和礦質元素作為植物的天然“指紋”而成為其產地溯源確證的重要技術。植物生長代謝直接與環境進行物質、能量交換，體內的碳、氮、氧穩定同位素在物理、化學和生物化學過程中受土壤、氣候、地形等因素影響發生自然分餾，導致同位素比值變化，使不同來源植物的同位素存在自然差異，進而反映所處環境[18-19]。植物的δ13C 值與光合作用途徑密切相關，根據碳光合作用途徑將其分為C3植物、C4植物和CAM 植物；C3植物δ13C 值介于-35‰～-20‰，C4植物δ13C 值介于-17‰～-9‰，CAM 植物δ13C 值介于-22‰～-10‰[20-21]。植物δ13C值還受溫度、土壤水分、濕度、光照、CO2濃度等因素的影響[22]，具有地理特征。因此根據δ13C 值的差異，可進行農產品的產地溯源。蘭州百合δ13C 值在-25.82‰～-24.05‰之間，屬于C3植物，其δ13C 屬于弱變異，原因是植物代謝活動對δ13C 的影響大于環境因子。植物δ18O 因水循環過程中擴散、蒸發、蒸騰等發生變化[23]，而農產品氧同位素主要來自灌溉水和產地降水[24-25]。蘭州百合δ18O 無差異，可能其產地間灌溉水和降水量相差不大。植物中δ15N 值因氣候、品種、肥料、土壤、降水量、溫度等因素共同作用造成其δ15N 值差異較大[26]；另外，氮同位素分餾效應還受到農業生產的影響，農產品中15N/14N 的比值與其地區農業生產有關，其中農業施肥影響最大[27-28]。不同產地蘭州百合δ15N 差異較大，黃峪鎮δ15N 最高，可能在栽培過程中施用了綠色有機肥；而西果園鎮和阿甘鎮的δ15N 也顯著高于中鋪鎮，可能與產地間施肥活動有關。

植物體內的礦質元素特征主要與其生長地域土壤中的礦質元素組成、土壤基質狀況、施肥密切相關[29-30]；還與生長環境中的灌溉水、大氣、氣候，植物種類等因素有關[31]。農產品礦質元素是從土壤中吸收的無機元素離子，環境中礦質元素在其體內不斷積累，造成不同地域來源農產品體內礦質元素含量有較大差異[32]。因此可以通過分析農產品礦質元素的組成差異，為其產地溯源提供獨特的標識。本研究中，供試樣本產地多以黃綿土、栗鈣土和灰鈣土為主，土壤質地以中壤土和輕壤土為主，由于土壤類型不同，土壤中所含的礦質元素不同，造成蘭州百合生長過程中富集礦質元素存在差異，其次，產地間受人類施肥活動的影響，其吸收利用的礦質元素含量存在差異。在所測礦質元素含量中，K、Mg、Na、B、Fe、Mn、Cu、Mo、Cr、Cd 差異顯著（P＜0.05）。雖然礦質元素含量在蘭州百合產地判別方面存在顯著差異，但需要結合多元統計學分析方法、綜合分析多種因素才能更加準確的進行產地溯源，得到更理想的結果[33-34]。

鹿保鑫等[35]基于30 種礦質元素含量對黑龍江北安市及黑河市嫩江縣42 份大豆產地溯源，并用模型確定Na、K、Mn、Rb、Ba 和Au 是區分兩大產區的特征指標，判別正確率為100%。王潔等[36]追溯山東、四川、浙江、貴州扁茶，測定其同位素比率，并借助化學計量學工具探索穩定同位素溯源茶葉潛力，其模型預測準確度達到92%。張欣昕等[37]分析了基于穩定同位素和礦質元素含量對內蒙古、黑龍江、新疆、四川和廣東的馬鈴薯進行產地判別，結果表明，δ13C 和δ15N 建立的產地判別模型判別正確率為82.0%，篩選出8 種礦質元素建立的產地判別模型正確判別率為89.3%；在穩定同位素和礦質元素的綜合指標下，不同產地的整體判別正確率94.7%，交叉驗證判別正確率93.2%，均比穩定同位素和礦質元素獨立判別正確率高，說明穩定同位素和礦物元素指標組合是馬鈴薯產地溯源的有效方法。本研究測定了測定蘭州百合4 個主產區（阿甘鎮、黃峪鎮、西果園鎮、中鋪鎮）3 種穩定同位素和16 種礦質元素含量并分析產地間特征及差異，結合PCA、OPLS-DA 和LDA分析，追溯蘭州百合地理來源，確定δ13C、δ15N、Na、Cr、Cd 是區分蘭州百合地理來源的重要變量，有監督的分類模型OPLS-DA 判別效果優于LDA,正確率為100%。結果證明穩定同位素比率和礦物元素指紋聯合是追溯蘭州百合產地的有效指紋技術。

4 結論

本研究利用IRMS 和ICP-MS 測定蘭州百合3 種穩定同位素δ13C、δ15N、δ18O 和16 種礦質元素（K、Mg、Ca、Na、B、Fe、Zn、Al、Mn、Cu、Mo、Cr、Cd、Se、As、Pb）含量并分析產地間特征及差異，并結合PCA、OPLS-DA、LDA 模型進行溯源驗證。結果表明：δ13C、δ15N、K、Mg、Na、B、Fe、Mn、Cu、Mo、Cr、Cd 在產地間存在顯著差異（P＜0.05）；基于差異顯著（P＜0.05）的穩定同位素和礦質元素含量的PCA分析和OPLS-DA 判別分析表明δ13C、δ15N、Na、Cd、Cr 在蘭州百合產地溯源確證中發揮重要作用。OPLSDA 和LDA 模型判別正確率均為100%，但LDA的LOO-CV 判別正確率為88.89%，OPLS-DA 優于LDA，為100%，產地溯源判別驗證效果最佳。由此可見，穩定同位素和礦質元素含量結合多元統計分析可有效實現蘭州百合產地區域的正確區分。其中，LDA 和OPLS-DA 模型均能夠對黃峪鎮、西果園鎮、阿甘鎮和中鋪鎮樣品100%準確識別。因此，可進一步擴展研究區域，結合分類模型篩選貢獻率較大的指標構建新的模型，實現蘭州百合精細判別，為蘭州百合產地溯源、質量安全可追溯體系的建立完善和開發應用提供一定的理論依據。