HPLC 法檢測蜜餞中20 種合成著色劑含量

冉 丹，羅蘇蘇，張可欣，肖玥惠子，王淑霞，徐思敏，李 萌

（湖南省產商品質量檢驗研究院食品安全監測與預警湖南省重點實驗室，湖南長沙 410007）

合成著色劑又稱合成色素，是一種重要的食品添加劑，可以改善食品色澤，較天然色素具有成本低、著色力好等優勢，因而廣泛被應用于食品工業[1-3]。在食品抽檢過程中發現，合成著色劑在蜜餞產品中應用較多，如口味姜、獼猴桃果脯、楊梅涼果、芒果干等，一些蜜餞產品合成著色劑超標情況頻頻出現。而合成著色劑作為一種化工產品，長期食用對人體存在一定的潛在危害[4-6]。因此，為保障食品安全，蜜餞中合成著色劑的檢測仍然是工作重點。

目前適用于測定蜜餞中合成色素的標準方法為GB 5009.35-2016[7]，該方法在蜜餞測定過程中存在諸多方面的問題[8-9]。該標準采用液液分配法和聚酰胺粉吸附法分別測定赤蘚紅和其他6 種合成著色劑，操作繁瑣、耗時長，不利于實現批量檢測。此外蜜餞樣品在抽提過程中，其殘渣極容易堵塞垂融漏斗，造成抽提困難，實驗難以進行。聚酰胺粉吸附法操作不當，難以保證較好的回收率。

根據GB 2760-2014 規定[10]，我國允許在食品中添加的有機合成色素有11 種，分別為檸檬黃、日落黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、亮藍、赤蘚紅、酸性紅、誘惑紅、靛藍、喹啉黃。就現有的標準檢測方法來看[7,11-13]，均只覆蓋部分產品類別和部分色素項目，難以滿足實際檢測需要。值得重視的是，和歐盟及其他國家法規相比較[14-16]，我國在合成著色劑方面的監管還存在滯后情況，例如我國專利藍V、橙黃、麗春紅S 等還并未納入監管范疇，也沒有相應的檢測標準和方法，而在歐盟及其他國家已被允許應用于食品工業。國外一些關于此類新型色素已屢有報道，如2019年6 月輸日食品違反日本食品衛生法的情況，通報了源產地為俄羅斯的點心專利藍Ⅴ非法添加[17]；2020年12 月3 日，歐盟發布條例（EU）2020/1819，修訂（EC）No 1333/2008 附件Ⅱ中關于在鮭魚替代品中的色素使用規定[18]，其中就包含了橙黃和麗春紅S。由此可見，面對品類繁多的新型合成著色劑，我國相應的法律法規及市場監管亟待完善。

目前關于色素的分析研究，已有很多文獻報道，如劉珈伶[19]固相萃取法測定冰淇淋中6 種合成色素，唐一秋[20]采用色素專用柱測定茶飲料中9 種合成著色劑，夏宗艷等[21]采用90%丙酮作為提取劑，固相萃取法測定食品中8 種色素，高家敏等[22]采用高效液相色譜法同時測定飲料中12 種水溶性合成著色劑。但現有的文獻基本都是基于特定的樣品基礎，選擇性對部分色素類別進行研究，沒有基于合成色素結構特性，開發具有普適性的檢測方法。本研究旨在以蜜餞為樣品基礎，建立一個具有普適性的，可以檢測同類型合成著色劑的方法，并可以擴展應用到其他食品類別。同時對前處理各關鍵影響因素進行探索研究，優化色譜條件，以實現復雜基質樣品中合成色素準確、高效、高通量的檢測分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

標準品：檸檬黃（CAS 1934-21-0，0.5 mg/mL）、新紅（CAS 220658-76-4，1.0 mg/mL）、莧菜紅（CAS 915-67-3，0.5 mg/mL）、日落黃（CAS 2783-94-0，0.5 mg/mL）、胭脂紅（CAS 2611-82-7，0.5 mg/mL）、亮藍（CAS 3844-45-9，0.5 mg/mL）、赤蘚紅（CAS 16423-68-0，純度86.0%）、酸性紅（CAS 3567-69-9，純度87.4%）、誘惑紅（CAS 25956-17-6，純度86.0%）、酸性橙2（CAS633-96-5，純度80.8%）、靛藍（CAS 860-22-0，1.0 mg/mL）、麗春紅S（CAS 6226-79-5，純度91.4%）、喹啉黃（CAS 8004-92-0，純度90.5%）、專利藍Ⅴ（CAS 3536-49-0，純度89.7%）、酸性紅44（CAS 2766-77-0，純度85.0%）、食品紅1（CAS4548-53-2，純度90.5%）、橙黃1（CAS 523-44-4，純度88.3%）、酸性橙8（CAS 5850-86-2，純度99.9%）、亮藍G（CAS 6104-58-1，純度91.4%）、酸性紅50（CAS 5873-16-5，純度60.6%）均購于上海安譜公司。

乙酸銨、無水乙醇、氨水（分析純），甲醇、乙腈（色譜純）國藥集團；Inspire C18色譜分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）迪馬科技有限公司；聚酰胺柱Cleanert PA（1 g/6 mL）天津博納艾杰爾科技有限公司；混合型強陰離子反相固相萃取柱 ProElut PXA（150 mg/6 mL）、混合型弱陰離子反相固相萃取柱ProElut PWA（150 mg/6 mL）、混合型弱陰離子反相固相萃取柱ProElut PWA-2（150 mg/6 mL）迪馬科技有限公司；混合型弱陰離子反相固相萃取柱Cleanert PWAX 柱（150 mg/6 mL）天津博納艾杰爾科技有限公司；混合型弱陰離子反相固相萃取柱CNW poly-sery PWAX（150 mg/6 mL）、CNW polysery 色素專用固相萃取柱（500 mg/6 mL）上海安譜公司；樣品材料口味姜、甜心金桔干、獼猴桃干、金梅姜等 源于抽檢殘余樣品及市場采購。

島津LC-20A 高效液相色譜儀（配DAD 檢測器）島津（中國）有限公司 ；Milli-Q 超純水儀 德國默克密理博公司；VGT 超聲波振蕩儀 廣東固特公司；M37610-33 渦旋振蕩器 賽默飛世爾公司；SHZ-W 恒溫水浴鍋 常州萬順儀器制造有限公司；TD-6 高速離心機 萬和儀器制造公司；HPD 24 位固相萃取裝置 色譜科儀器公司；MTN-2800W 氮吹濃縮儀 天津奧特賽恩斯儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理 樣品取可食部分，經充分粉碎后混合均勻，稱取5.0 g（精確至0.01 g）于50 mL 具塞比色管中，加入20 mL 提取劑（甲醇:氨水=10:1，v/v），渦旋混勻后超聲10 min，重復提取兩次，上清液水浴蒸發至近干，3～5 mL 水少量多次溶解轉移至15 mL離心管，加入100 μL 甲酸混勻，待凈化。依次用5 mL甲醇、5 %甲酸水溶液活化混合型弱陰離子反相固相萃取柱ProElut PWA-2，將待凈化液轉移至萃取小柱，控制流速每秒1 滴，再依次用5 mL 5 %甲酸、甲醇淋洗，棄去淋洗液，用6 mL 5 %氨水甲醇洗脫，收集洗脫液，氮吹濃縮至近干，流動相（甲醇:20 mmol/L乙酸銨=2:8，v/v）溶解定容至1 mL，過PTFE 膜，待測。

1.2.2 液相色譜參考條件 島津LC-20A 高效液相色譜儀（配DAD 檢測器）；色譜柱：Inspire C18色譜分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；檢測波長：254 nm/428 nm/509 nm/625 nm；流速：1.0 mL/min；流動相A 為甲醇，流動相B 為20 mmol/L 乙酸銨溶液，梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions

1.2.3 標準溶液 稱取固體標準品各5.0 mg（按純度折算后的質量），水定容至10 mL 容量瓶，配制濃度為0.5 mg/mL 標準儲備液，新紅、靛藍液體標準品直接稀釋至0.5 mg/mL，分別準確移取0.01、0.1、0.2、0.4、1.0、2.0 mL 標準儲備液于50 mL 容量瓶中，水定容至刻度，配得濃度為0.1～20 μg/mL 系列標準工作液。按1.2.2 進行分析測定，記錄線性方程及相關系數。

1.2.4 方法學考察 選擇空白基質樣品，分別加入不同濃度水平的標液，每個水平重復分析測定6 次，進行加標回收與精密度試驗。以供試液響應最低項目的3 倍信噪比及10 倍信噪比確定檢出限與定量限。

1.3 數據處理

通過與島津LC-20A 儀器配套的Labsolution色譜處理軟件完成數據采集分析，采用 Excel 軟件進行圖形繪制及處理，結果統計為 3 次平 行測定結果。

2 結果與分析

2.1 提取劑的選擇

提取是分析檢測的第一步，也是關鍵步驟，如果提取溶劑選擇不當，會直接影響目標物回收率。有文獻提出采用水溶液超聲提取[23]、亞鐵氰化鉀-乙酸鋅-水溶液沉淀提取[24]、丙酮/水溶液提取[21]、乙醇/氨水/水溶液提取[25]、乙腈/氨水溶液提取[26]、甲醇/氨水溶液提取[27]等方法提取著色劑。本研究就以上各種提取溶劑進行了比較，以檸檬黃、胭脂紅、日落黃、酸性橙2 四種極性有差異的合成著色劑為監測指標，以蜜餞加標樣品作為分析對象，研究其提取效果及回收率，回收率為統計3 次平行試驗結果值，如表2。

表2 不同提取溶劑的提取效果及回收率比較Table 2 Comparison of extraction effect and recovery rate with different extraction methods

以上結果表明，采用乙醇/氨水/水、甲醇/氨水兩種提取溶劑時回收率較高、便于操作。通過分析合成著色劑分子結構式，發現除靛藍外，赤蘚紅為苯甲酸鈉結構，其他合成著色劑均為苯磺酸鈉結構，而含此類酸性基團的色素更容易被堿性提取溶劑提取。采用乙腈/氨水提取，雖然回收率高，但因某些蜜餞樣品可能會添加氯化鈉、山梨酸鉀、苯甲酸鈉、焦亞硫酸鈉及糖類，產生鹽析和糖析現象，應用范圍存在局限。為進一步探索比較乙醇/氨水/水、甲醇/氨水兩種提取方式，選取口味姜絲、芒果干及甜心金桔三種樣品類型分別進行比較研究。試驗發現，在檢測分析甜心金桔干樣品時，采用乙醇/氨水/水、甲醇/氨水兩種提取溶劑，日落黃、酸性橙2 回收率差異不大，但乙醇/氨水/水提取，檸檬黃、胭脂紅回收率很低，平行性很差，高低相差近10 倍，測試結果見表3。所以本研究提取液采用甲醇/氨水作為優化選擇的樣品提取液。

表3 不同提取劑對不同樣品的色素回收率比較（%）Table 3 Comparison of colorant recovery rate of different extractants for different samples (%)

通過對不同比例甲醇/氨水進行試驗，發現氨水比例越高，提取效果越好，結果見圖1。但甲醇/氨水比例到達20:1 后，增加氨水比例，回收率影響并不明顯，考慮到某些樣品本身可能含有天然酸性物質，會中和少量堿，所以提取溶劑宜增大氨水使用比例。當甲醇/氨水比例為5:1 時，增加后續蒸發濃縮時長。故最終本文選擇的甲醇/氨水比例為10:1。

2.2 固相萃取柱選擇

現有國標多采用聚酰胺吸附法凈化合成著色劑，該法成本低，但過程繁瑣耗時，不利于實現批量檢驗。固相萃取技術是目前常用的凈化手段，能有效提取目標物，在檢測領域應用廣泛。也有文獻對固相萃取柱在合成著色劑方便的應用進行了探索，如劉秀娟等[28]采用HLB 柱凈化餅干中合成著色劑；任榮軍等[29]采用Cleanert-PWAX 柱凈化中成藥中合成著色劑；劉珈伶等[19]采用Oasis WAX 柱凈化冰淇淋中合成著色劑。由于合成著色劑多為苯磺酸、苯甲酸類有機酸，若采用C18、HLB 硅膠基質SPE 柱，保留較弱，難以吸附，或在淋洗階段被洗脫。結合色素結構特性，選擇陰離子交換模式較為適宜，市面上陰離子交換柱類型較多，本試驗選擇國產3 個品牌7 種固相萃取小柱進行比較研究，分別為聚酰胺柱：Cleanert PA（1 g/6 mL），混合型強陰離子反相固相萃取柱：ProElut PXA（150 mg/6 mL），混合型弱陰離子反相固相萃取柱：ProElut PWA（150 mg/6 mL）、ProElut PWA-2（150 mg/6 mL）、Cleanert PWAX 柱（150 mg/6 mL）、CNW poly-sery PWAX（150 mg/6 mL），CNW poly-sery 色素專用柱（500 mg/6 mL）。本實驗通過對同一加標樣品加入甲醇/氨水進行提取，蒸發濃縮后加入甲酸，以保證待凈化液偏酸性，再采用相同的淋洗和洗脫條件進行SPE 凈化處理（見1.2.1），以測試7 種固相萃取柱對不同色素的回收率，統計3 次平行測試結果如下表4。試驗表明聚酰胺柱Cleanert PA 對麗春紅S、胭脂紅、酸性紅等保留性強難以洗脫；混合型強陰離子反相柱ProElut PXA 對所有色素有極強吸附保留作用；混合型弱陰離子反相柱ProElut PWA 比ProElut PWA-2 保留性更強，部分色素回收率偏低；CNW poly-sery 色素專用柱對亮藍、專利藍Ⅴ、亮藍G 保留性較弱，在甲醇淋洗階段被部分洗脫，回收率偏低。洗脫液氨水比例從5%提升到20%，聚酰胺柱和混合型強陰離子反相柱對部分色素仍有強保留，因此不適宜色素分析。不同的弱陰離子反相柱可能最優淋洗和洗脫條件有所差異，在本試驗條件下，ProElut PWA-2、cleanert PWAX、CNW polysery PWAX 性能相當，各色素均有較好的回收。本實驗建立的方法選擇ProElut PWA-2 作為凈化SPE 柱。

表4 不同固相萃取柱回收率比較（%）Table 4 Comparison of recovery rate with different solid phase extraction columns (%)

2.3 針式過濾器及色譜分析柱的選擇

針式過濾器是實驗室最為常見的、使用頻率很高的耗材，多用于上機前最后一步凈化處理。然而某些材質的針式過濾器對目標物可能存在吸附作用，直接影響最終回收率。目前市面上主要濾膜材質分為6 種，具體分類及性能如下表5 所示。為研究6 種濾膜（均選用0.45 um）對合成著色劑是否吸附作用，選用濃度為2.0 μg/mL 的混合標樣進行測試。結果表明，尼龍膜對合成著色劑吸附作用最為明顯，其他膜對赤蘚紅存在一定吸附，PTFE 膜對合成色素基本無吸附作用。

表5 不同濾膜材質類型及使用性能Table 5 Different material types of filter membrane and its application performance

色譜分析柱如選擇不當，容易導致檸檬黃與新紅分離度較差，通過優化條件也難以改善。本研究選用Inspire C18色譜分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）作為色譜分析柱，以甲醇-20 mmol/L 乙酸銨為流動相體系，通過優化條件，按表1 條件梯度洗脫，20 種合成色素30 min 可以完成很好分離，標準溶液色譜圖見圖2。

圖2 標準溶液色譜圖Fig.2 Standard solution chromatography

2.4 檢測波長的選擇

目前國家標準和文獻方法檢測波長多選用254 nm，但實際檢測中發現復雜基質樣品中大部分干擾物在254 nm 均有吸收，容易干擾積分判斷。此外亮藍、靛藍、專利藍Ⅴ在紫外區靈敏度很低，往往定量不準，難以滿足實際檢測需要。本實驗采用可見波長進行定量分析，二極管陣列檢測器（DAD）對20 種色素在200～800 nm 范圍內進行全波長掃描，各種合成著色劑最大吸收波長見表6，綜合考慮檢測器通道的限制，最終選擇428、509、625 nm 為定量波長。

2.5 方法學考察

2.5.1 線性范圍、檢出限、定量限 將1.2.3 的系列標準溶液，按優化的色譜條件進行測定，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性擬合。結果可知，20 種合成色素在0.1～20 μg/mL 內均呈良好的線性，相關系數符合GB/T 27404-2008 中附錄F.2 要求，不同種類合成著色劑的最大吸收波長、定量波長、線性方程及相關系數見表6。在本試驗條件下對供試液進行稀釋，以單位濃度峰面積響應最低的靛藍3 倍信噪比確定檢出限，10 倍信噪比確定定量限，結果如下表6。本方法檢出限均可以達到GB5009.35-2016 檢出限（0.5 mg/kg）要求。

表6 20 種合成著色劑最大吸收波長、定量波長、線性方程、檢出限及定量限Table 6 Maximum absorption wavelength,quantitative wavelength,linear equation,detection limit and quantitative limit of 20 synthetic colorants

2.5.2 加標回收率、精密度 選擇一未添加色素的口味姜作為空白基質，按三個濃度水平進行加標，分別為1.0、5.0 和50 mg/kg，每個水平重復分析測定6 次，計算回收率和相對標準偏差（RSD），結果如表7。實驗結果表明，20 種合成色素在1.0 mg/kg 添加水平回收率為84.0%～101.7%，RSD 為1.6%～4.4%；5.0 mg/kg 添加水平回收率為90.1%～104.3%，RSD為1.3%～4.9%；50 mg/kg 添加水平回收率為90.2%～104.5%，RSD 為1.4%～5.3%。回收率及精密度符合GB/T 27404-2008 中附錄F.1、F.3 要求。

表7 20 種合成著色劑不同添加水平的回收率和精密度（n=6）Table 7 Recovery and precision of 20 synthetic colorants with different additive levels (n=6)

續表7

2.5.3 實際樣品分析 目前適用于檢測蜜餞中合成著色劑的標準為GB5009.35-2016。為驗證本實驗方法，并進一步與標準檢測方法進行比較分析，選擇添加有合成著色劑的甜心金桔干、獼猴桃干和金梅姜作為分析對象，按步驟1.2 進行檢測分析，結果如表8。試驗結果表明，甜心金桔干檢出胭脂紅和日落黃，胭脂紅超出GB2760-2014 限量標準0.05 g/kg；獼猴桃干檢出檸檬黃和亮藍；金梅姜檢出胭脂紅，超出GB2760-2014 限量標準0.05 g/kg。由表8 可見，采用本方法檢測分析陽性樣品，定量結果均高于國標方法，回收率更高，操作更加便捷，具有更好的優勢。

表8 蜜餞中合成著色劑的檢測方法比較（mg/kg）Table 8 Comparison of detection methods of synthetic colorants in candied fruit (mg/kg)

3 結論

本研究采用二極管陣列反相高效液相色譜對蜜餞中20 種合成著色劑進行分析檢測。對不同提取試劑的提取效率進行比較優化，選擇甲醇/氨水溶液作為樣品提取液；對7 種不同的SPE 柱進行比較分析，選擇混合型弱陰離子反相固相萃取柱進行樣品凈化；對不同過濾膜進行比較優選；對檢測波長及儀器條件進行優化。從線性方程、檢出限、定量限、回收率、精密度等方面進行方法學考察，并對不同品類的實際樣品進行測試分析。結果表明，該方法操作便捷、穩定性好、回收率高，可以有效解決目前在蜜餞檢測過程中遇到的困難，并可以參考應用于其他食品類別，為色素類檢測標準的制訂及修訂提供參考依據。