1例疑似溶血性曼氏桿菌感染的診斷及生物信息學分析

梁成孔，孫鵬亮，李蓮瑞*

（1.塔里木大學動物科學學院新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300；2.塔里木大學動物科學學院新疆生產建設兵團南疆動物疫病診斷與防控工程實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

溶血性曼氏桿菌（Manniella hemolyticus）又稱溶血巴氏桿菌，屬巴氏桿菌科曼氏桿菌屬，為革蘭氏陰性且兼性厭氧菌，是一種條件性致病菌。溶血性曼氏桿菌在牛羊鼻咽和扁桃體中屬于正常菌群，當機體防御受到各種應激因素（如運輸、營養(yǎng)不良、不利的物理、環(huán)境或氣候條件以及之前或同時感染某些呼吸道病毒、支原體或其他類型的細菌）損害時均可致病[1-2]。肺炎性巴氏桿菌病是世界范圍內分布的牛、綿羊和山羊的重要呼吸道疾病之一，被認為是一種人畜共患疾病，可導致支氣管擴張、支氣管炎、肺炎、尿路感染、腦膿腫、敗血癥，通常由甲型溶血性曼氏桿菌引起[3-4]。近年來羊群感染溶血曼氏桿菌引起呼吸道疾病時有發(fā)生，對養(yǎng)羊業(yè)造成了一定的威脅[5-9]。目前市場上缺乏規(guī)范的商品化疫苗預防該病，且該病原菌存在多個抗原，商品化疫苗具有局限性，只能保護部分免疫作用[10]。

2021年5月，新疆阿克蘇市某養(yǎng)羊場發(fā)生疫情，30日齡的羔羊病死率達到20%以上。發(fā)病羊主要表現為呼吸困難、流鼻涕、咳嗽、拉稀、體溫升高至42℃。本研究剖解發(fā)病羊，取肺、肝、腸、腸系膜淋巴結等組織，從病原中分離出毒株，通過PCR、16SrRNA鑒定，以期為今后該病的防控工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

病料來自新疆阿克蘇市某養(yǎng)羊場30日齡羔羊的肺、肝、腸、腸系膜淋巴結。

1.2 試劑與儀器

主要試劑：DNA純化試劑盒、瓊脂糖、Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA Marker（北京全氏金生物技術有限公司）。

主要儀器：干式恒溫箱（杭州奧盛儀器有限公司）、DK-8D電熱恒溫水槽（上海精宏實驗設備有限公司）、伯樂T100梯度PCR儀（北京智杰方遠有限公司）、凝膠成像分析系統(tǒng)（ChemiDoc XRS）。

1.3 試驗方法

1.3.1 DNA提取

精確稱取1 g病料加入1 mL PBS溶液放入打碎機打碎5 min，取200~300μL。按照DNA提取試劑盒說明書提取DNA。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.3.2 巴氏桿菌PCR擴增

以提取的DNA為模板進行PCR擴增。

反應體系為：premix Taq(10×Ex Taq Version 2.0)0.5μL、10μmol/L上游引物1μL、10μmol/L下游引物1μL、DNA模板5μL、buffer 2.5μL、dNTP 1μL、RNasefree H2O 14μL。

PCR反應條件：98℃預變性10 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，32個循環(huán)；72℃退火10 min。擴增產物跑電泳觀察結果。

1.3.3 16SrRNA擴增

以提取的DNA為模板進行PCR擴增。

反應體系為：2×Pro Taq Master Mix 25μL、10μmol/L 27F 1μL、10μmol/L 1492R 1μL、DNA模板5μL、ddH2O 10μL。

PCR反應條件：94℃預變性30 s；98℃變性20 s，53℃退火1 min，72℃延伸1 min，33個循環(huán)；72℃延伸2 min。擴增產物跑電泳觀察結果。

1.3.4 生物信息學分析

使 用 程 序ProtParam、ProtScale、SignalP 4.1Server、NetPhos 3.1 Server和TMHMM Serverv2.0分析溶血曼氏桿菌蛋白的理化性質、疏水性、信號肽、磷酸化位點與跨膜結構域及溶血曼氏桿菌蛋白的二級結構。

2 結果與分析

2.1 臨床癥狀及病理變化結果（見圖1、圖2）

圖1 肺臟組織病變Fig.1 Pathological changes of lung tissue

圖2 腸系膜淋巴結腫大Fig.2 Enlarged mesenteric lymph nodes

患病綿羊體溫升高42℃，流漿液性、黏液性鼻液，呼吸困難、咳嗽、運動量減少，經常躲在墻角，被毛粗亂，角膜潮紅、濕潤。

由圖1、圖2可知，發(fā)病羊肺臟充血、出血、實變，肝臟瘀血、出血，腸道出血、膽囊充盈、腸系膜淋巴結腫大、出血，胃內含有未消化的乳凝塊。

2.2 巴氏桿菌PCR檢測結果（見圖3）

由圖3可知，陽性對照和肺臟在750 bp處出現明亮的條帶，與預期相符；肝臟、腸、腸系膜淋巴結均未出現明亮的條帶，初步說明該病羊感染了巴氏桿菌。

圖3 巴氏桿菌PCR檢測結果Fig.3 PCRtest results for Pasteurella

2.3 16SrRNA檢測結果（見圖4）

自瓊脂平板上挑取一個單個菌落作純培養(yǎng)測序。由圖4可知，發(fā)病羊感染溶血性曼氏桿菌。

圖4 16S rRNA檢測結果Fig.4 16SrRNA test result

2.4 溶血性曼氏桿菌蛋白親疏水性分析（見圖5）

圖5 溶血性曼氏桿菌蛋白親疏水性分析Fig.5 Hydrophilicity and hydrophobicity analysis of proteinsof M.haemolyticus

由圖5可知，溶血性曼氏桿菌蛋白由450個氨基酸組成，正負電氨基酸分別為59和47；不穩(wěn)定系數是46.39，當不穩(wěn)定系數大于40時，說明該蛋白為不穩(wěn)定性蛋白。平均親水值（CRAVY）為-0.580，脂肪族系數為46.14。PoatScale程序對溶血性曼氏桿菌蛋白的親疏水性分析和平均親水值判斷，該蛋白為親水性蛋白。

2.5 溶血性曼氏桿菌信號肽、磷酸化位點及跨膜域結構域的預測分析（見圖6、圖7）

由圖6、圖7可知，溶血曼氏桿菌無信號肽和跨膜結構域，有54個磷酸化位點，其中33個絲氨酸、17個蘇氨酸和4個酪氨酸磷酸化位點。

圖6 溶血性曼氏桿菌蛋白的跨膜結構域Fig.6 Transmembrane domain of proteins of M.haemolyticus

圖7 溶血性曼氏桿菌蛋白的磷酸化位點Fig.7 Phosphorylation sitesof proteinsof M.haemolyticus

2.6 溶血性曼氏桿菌二級結構預測（見圖8）

圖8 溶血性曼氏桿菌二級結構預測Fig.8 Prediction of thesecondary structureof M.haemolyticus

由圖8可知，利用SOPMA分析溶血性曼氏桿菌蛋白由α-螺旋、β-轉角、無規(guī)則卷曲以及延伸鏈4種結構組成二級結構。無規(guī)則卷曲蛋白表結構松散容易與抗體結合，可作為抗原表位，優(yōu)勢區(qū)段為：22~24、32~35、60~64、71~75、83~90、108~113、121~131、140~159、164~167、174~180、186~189、196~200、215~217、229~241、249~259、265~273、275~283、288~291、296~300、307~312、325~333、342~358、262~364、378~386、408~436、440~446、448~450。

3 討論

溶血性曼氏桿菌是一種球狀短桿菌，菌體兩端鈍圓，周圍可見明顯的莢膜，為無鞭毛、無芽孢的革蘭氏陰性菌，通常以單一、成對散在排列；瑞氏染色、革蘭氏染色或美藍染色后呈兩極濃染。溶血性曼氏桿菌形態(tài)與巴氏桿菌相似[1,11-13]，只在反芻動物體內才能夠分離到，牛在運輸過程中更易發(fā)生該病[14]。因此，可推斷在應激環(huán)境的刺激下可誘發(fā)溶血性曼氏桿菌病。溶血曼氏桿菌具有大量的血清型，A1和A2是最優(yōu)勢菌株。A2是導致綿羊發(fā)病的最為常見的血清型，A7血清型也可引起綿羊中急性暴發(fā)。此次引起羔羊死亡的是血清型A2還是A7，或是其他未被發(fā)現的致病性血清型仍需進一步研究。

溶血曼氏桿菌在免疫系統(tǒng)中可與其他微生物合作，強化機體的防御功能。當外界環(huán)境由于各種原因發(fā)生變化，機體的防御系統(tǒng)下降，導致維持機體與共生菌的平衡能力失去平衡，溶血性曼氏桿菌感染機體導致發(fā)病[11]。溶血性曼氏桿菌大量繁殖的過程中產生毒力因子，如莢膜、脂多糖、白細胞毒素外膜蛋白等，形成肺靜脈、毛細血管和淋巴管血栓，導致肺缺血性壞死和纖維素性滲出物沉積的炎癥反應，引發(fā)纖維素性肺炎，發(fā)病羊出現呼吸困難、流鼻涕和咳嗽等癥狀，與本研究中患病羊的臨床癥狀相符。

本試驗利用PCR技術成功擴增出目的基因，得到目的基因片段大小為750 bp，與預期大小相符；通過16SrRNA進行進一步確定，測序結果顯示為溶血性曼氏桿菌。從生物信息學分析，溶血曼氏桿菌蛋白揭示，該蛋白無信號肽、跨膜結構域。信號肽標記蛋白質分泌途徑和蛋白質目標位置，溶血曼氏桿菌蛋白無信號肽，說明此蛋白無分泌功能。該蛋白為混合性蛋白，穩(wěn)定性差，發(fā)生盤旋和扭曲概率高，和抗體分子結合比例大。因此，該區(qū)域可能存在B細胞抗原表位[15-18]。但其他區(qū)域或許還存在更多的抗原表位，仍需進一步試驗加以確認。

4 結論

本研究通過分子生物學診斷技術和臨床癥狀觀察，確定阿克蘇某羊場羊可能感染溶血性曼氏桿菌，并利用生物信息學分析該蛋白的特性，為進一步研究該病提供參考。