牛病毒性腹瀉膠體金檢測中樣本類型和相關干擾物研究

高 萌，孫曉笛，陸維克

（杭州奧泰生物技術股份有限公司，浙江 杭州 310018）

牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）所引起的疾病也稱為黏膜病，是世界范圍內牛的一種常見感染性疾病[1]，也是最重要的牛病之一[2]。BVDV是黃病毒科瘟病毒屬的一個成員[3]，可感染各年齡階段的牛，年齡越小易感性越高。BVDV能夠引起包括呼吸系統和生殖系統在內的多個器官系統疾病[4-5]，具體臨床表現通常取決于感染病毒毒株的毒力，主要造成患病母牛的生育力和產奶量下降、流產以及胎兒生長緩慢等情況[6]。即使母牛妊娠期滿后能夠順利產下犢牛，犢牛卻對該病毒具有“免疫耐受”的現象。持續感染小牛（PI）是群體中新的重要傳染源[7-8]，主要通過分泌的體液持續釋放大量病毒。在幼牛身上的短暫感染（TI）可能會引起皮炎、上消化道潰瘍、發熱、腹瀉、白細胞減少咳嗽等癥狀，甚至導致死亡[9]。牛病毒性腹瀉在世界各國普遍存在，可嚴重影響牛的繁殖和生產，對養牛業造成了巨大的經濟損失。牛病毒性腹瀉雖然以其主要宿主命名，但在非牛物種中也具有一定的流行率。大多數野生反芻動物對BVDV易感，多種家養非牛類物種也可攜帶和傳播此病，大多數呈短暫感染所致常見的BVDV綜合征，如生殖功能不全、呼吸道疾病和免疫抑制。目前牛源性傳播的可能性雖尚未完全確定，但已有研究在羊、豬、水牛、鹿和駱駝等動物中發現BVDV，且已證明BVDV可在羊牛間進行傳播[10-13]。

目前尚無治療BVDV的特效藥物，預防主要通過接種弱毒疫苗和滅活疫苗提高牛機體的自身免疫力[14]。盡管已有商業疫苗可用，但市面上的許多滅活疫苗和改良活疫苗僅可應用于控制部分BVDV基因。有研究表明，接種疫苗在對新斷奶牛犢的預防效果上仍存在一定缺陷[15]。因此，明確該病的發病原因、加強牛群的免疫保護機制，并及時做出診斷和防治、降低感染風險，可有效降低牛產業的經濟損失。

1 病原特征

BVDV是一種病毒性疾病，病原體在顯微鏡下呈球形，直徑約為30 mm。BVDV通常為單鏈的RNA結構，有囊膜。在低溫環境下，病原體能夠長期保存且保持良好的活力，高溫和紫外線照射會對BVDV產生較強的滅活能力[16]。BVDV的基因組全長約12.3 kb，包含一個單一的開放閱讀框架（ORF），編碼一種多聚蛋白；該多聚蛋白可協同和翻譯后加工為成熟的病毒蛋白，ORF兩側有5'和3'非翻譯區（UTRs）[17]。根據對BVDV基因組5'端非編碼區、N末端自身蛋白酶（NPro）區或包膜糖蛋白（E2）區部分序列的系統發育分析，BVDV通常分為兩個不同的遺傳物種，即BVDV-1和BVDV-2。BVDV-1毒株是主要毒株，分布于世界各地；BVDV-2毒株主要存在于美國、加拿大和南美洲，也有研究報道存在于歐洲和亞洲[18]。1980年，中國首次發現感染BVDV的病例，病毒毒株分離自一個流產的牛胎（命名為changchun 184號）。

截至目前，BVDV在中國各地廣泛傳播，具有很高的流行率和豐富的遺傳多樣性。因BVDV具有較強的傳播能力和感染能力，牛染病后的血液、眼鼻分泌物、尿液、精液、初乳（或乳汁）以及糞便中均含有病原，從而導致其他易感牛發病。患病牛康復之后可能長時間攜帶病毒，并且反復發病[19]。

2 牛病毒性腹瀉膠體金抗原檢測中不同取樣方法比較

2.1 膠體金免疫層析技術

膠體金免疫層析技術是將膠體金作為示蹤物應用于硝酸纖維素膜上，在特定位置發生抗原抗體特異性反應的一種快速檢測技術，以簡便快速、成本低廉、安全無毒、特異性強等優點廣泛應用于臨床檢測中。Feldherr等[20]于20世紀60年代首次提出，將膠體金作為一種電鏡示蹤標志物；之后Faulk等[21]將膠體金作為示蹤物應用于免疫組織學的相關研究中。同酶聯免疫標記（ELISA）和聚合酶鏈反應（PCR）技術相比較，膠體金檢測技術具有更加簡單、方便、快捷的優勢[22]。近年來，膠體金免疫層析技術在檢測應用市場擁有廣闊的發展前景，在人類自身免疫缺陷病、傳染病、人畜共患病和毒品檢測等相關領域均有所涉及。王夢露等[23]利用間接膠體金技術建立了一種針對人血清中抗環瓜氨酸肽（CCP）抗體含量的定量檢測方法，并對試驗條件進行優化，以滿足臨床檢驗的需要。

在動物診斷中，膠體金免疫層析技術也具有廣泛的應用。為快速檢測及診斷犬細小病毒及其引起的傳染性疾病，劉潔等[24]研制了犬細小病毒膠體金檢測試紙條，經特異性研究試驗及與血凝試驗的對比，證明其具有良好的敏感性和特異性，與進口產品的總符合率為98%。有研究采用膠體金標記豬瘟病毒抗原，通過雙抗原夾心法建立豬瘟抗體檢測體系，對不同養豬場收集的20例可疑病例進行檢測，結果表明，膠體金性能與間接血凝和IDEXX實驗室檢測基本一致，總體符合率均在98%以上，具有較高的靈敏度，適用于豬瘟的臨床診斷[25]。大量相關研究報道，膠體金技術在動物疾病診斷中能夠獲得比較高的檢出率，表現出良好的特異性[26-28]。因此，將此技術廣泛應用于動物疾病診斷方面的價值非常高[29]。

2.2 不同取樣方法檢測比較

牛病毒性腹瀉抗原檢測的樣本類型有多種，如血液（血清）、奶樣、耳組織和鼻咽拭子。成年牛尾靜脈采血較為方便，但對于犢牛而言，采樣流程比較費時費力，采血的難度較大，且在血樣采集時牛極易出現應激反應，進而對牛的健康情況造成傷害。奶樣的采集方法相對簡單、方便、安全，對牛基本不造成影響，但缺點是適用范圍較小，僅能夠實施于泌乳牛群，無法檢測非泌乳牛群。耳組織的采樣方法更快速、損傷小，只需采集約2~3 mm的樣品，對牛幾乎不會造成損傷，尤其在飼喂時進行采集更省時省力[30]。鼻咽拭子的采集方法則更加簡潔，使用棉簽在牛鼻腔和咽喉部位輕輕刮取即可進行快速的樣品采集，對牛完全沒有損傷。

若母牛曾感染過BVDV或接種過BVDV疫苗，犢牛可攝入富含BVDV免疫球蛋白的初乳。已有研究表明，在使用抗原捕獲酶聯免疫吸附試驗（ACE）時，血清樣本和耳部組織樣本獲得的結果之間存在差異；在犢牛攝入初乳后，血清樣本呈陰性，但耳組織樣本在不同的生長發育階段均呈BVDV陽性[31]，即血清中源自初乳的抗體在PI犢牛中產生假陰性結果。因此，耳組織樣本被認為是能夠解決初乳衍生抗體干擾的一種解決方案。在存在初乳來源抗體的情況下采用ACE檢測，除耳組織外，血清、鼻拭子和唾液拭子均受到3周齡以下犢牛初乳衍生抗體的干擾[32]，其中鼻拭子的影響小于血清和唾液拭子，耳組織樣本的影響最小。

3 牛病毒性腹瀉抗原檢測的假陽性

3.1 其他抗體干擾

牛的血液樣本（全血、血清、血漿）中可能存在其他抗體的干擾，導致檢測結果呈假陽性。血清或血漿中的內源性異嗜性抗體，可與其他種屬的免疫球蛋白進行結合，包括作為免疫分析試劑的異源抗體。上述抗體可對免疫檢驗體系產生干擾，造成與實際分析物濃度無關的虛高檢測值，存在很大概率導致誤診。在人自身免疫性疾病（ADS）的免疫系統中會產生多種自身抗體，如類風濕因子（RF）、抗環瓜氨酸肽（抗CCP）和抗核抗體（ANA），可能導致交叉反應和血清學檢測的假陽性結果。

免疫分析的假陽性結果往往是由于自身抗體、異嗜性抗體和血清中的補體與檢測試劑中的抗體結合導致，但這些結合往往是非特異性的，且弱于特異性反應。在SARSCoV-2抗體檢測中，血清中高類風濕因子（RF）水平升高可能導致假陽性結果，尿素解離試驗有助于降低假陽性結果的發生率，使用高純度的抗體和適當的阻斷劑有助于提高其檢測的特異性[33]。因此，推測BVDV抗原檢測假陽性的出現可能與患牛的血液樣本中存在其他抗體的干擾有關。

3.2 藥物和樣本基質成分干擾

在牛病毒性腹瀉檢測過程中，藥物和樣本基質成分會對測試結果造成假陽干擾。首先，患牛若在測試之前服用過其他藥物，藥物將會通過體內代謝作用改變待測血液樣本的濃度和pH值，造成假陽性。其次，由于藥物本身或其代謝產物對免疫分析產生的效應造成體外干擾。再次，血液樣本（全血、血清、血漿）基質中含有的其他成分和本身的不穩定性也可能產生假陽性干擾。

其中，血漿樣本的主要干擾因素是血漿中含有纖維蛋白原和抗凝劑。在遠程運輸中，血清樣本的某些物質會發生不穩定性釋放。跨國運輸的對照血清在測試中出現了陽性干擾，此干擾是由于運輸過程中對照血清的非酯化脂肪酸釋放造成的。據推測，非酯化脂肪酸進行非特異性地結合血清蛋白，發生了競爭抗體結合位點現象，導致了測試結果的假陽性。也有試驗表明，某廠家的牛病毒腹瀉病毒抗原即時檢測產品在測試患牛血液樣本時會出現假陽性，更換使用耳組織樣本檢測且其他條件保持不變時，則不存在假陽干擾[32]。因此，在BVDV抗原的膠體金檢測中，患牛的血液樣本可能存在干擾物質造成結果異常，此時可選用耳組織進行檢測。

4 結論

綜上所述，在牛病毒性腹瀉BVDV抗原檢測的不同取樣方法比較中，奶樣適用范圍小，血樣采集難度大，且在初乳喂養的PI犢牛檢測中存在誤差。鼻拭子和唾液拭子上清液在初乳衍生抗體存在的情況下，表現出與血清相似的檢測局限性。耳組織是相對較好的樣本選擇，取樣快速，對牛的損傷小，還能夠避免初乳衍生抗體干擾問題。此外，血液樣本（全血、血清、血漿）中假陽性的出現可能是由于存在其他抗體、藥物和基質成分的干擾。

為提高后續BVDV抗原檢測的臨床診斷和治療水平，加強對血液樣本中產生的假陽性原因分析并做出合理的解決方案，建議采用更加簡便、快捷的耳部組織樣本取樣方法，減少初乳衍生抗體和假陽干擾。