重組人角質細胞生長因子2對遼寧絨山羊血清KGF-2濃度的影響

孫亞波，朱延旭，冀紅芹，賈富勃*，王春艷，吉尚雷，全治國，劉媛緣

（1.遼寧農業職業技術學院，遼寧 營口 115009；2.遼寧省現代農業生產基地建設工程中心，遼寧 沈陽 110032；3.遼寧省遼寧絨山羊原種場有限公司，遼寧 營口 115200）

角質細胞生長因子2（KGF-2）是成纖維細胞生長因子家族（FGFs）的一員，也稱成纖維細胞生長因子-10（FGF10）。KGF-2分子全長627 bp，編碼蛋白由208個氨基酸殘基組成[1]。KGF-2具有促進上皮細胞生長、增殖和分化的功能[2]，參與并調控多種組織器官的形成。有研究發現，敲除KGF-2基因大鼠的肺和前后肢未發育，牙齒和毛囊等也存在發育缺陷[3]。有研究認為，KGF-2存在于真皮乳突中，對皮膚組織和毛囊的發育具有調控作用[4]。嚴家榮等[5]研究發現，重組角質細胞生長因子2（rhKGF-2）對治療試驗大鼠角膜燒傷的效果較好；馬麗等[6]研究發現，燙傷大鼠外用rhKGF-2可促進皮膚傷口愈合和毛發再生；王澤[7]研究發現，脫毛大鼠采用rhKGF-2涂抹給藥，試驗后第14 d可明顯看到毛發再生。

上述文獻啟示，外源KGF-2可調控動物的毛發生長。柳楠等[8]對敖漢細毛羊不同部位皮膚毛囊中FGF10的mRNA和蛋白表達量進行對比研究發現，FGF10的蛋白表達量與毛囊發育存在正調節作用。羊絨是絨山羊皮膚內次級毛囊生長的一類無髓毛，經濟價值非常高。本試驗設想通過外源給藥的方式，將rhKGF-2補充進絨山羊皮內，探討其能否促進其次級毛囊發育，提升產絨量。已有文獻多數采用外用涂抹給藥方式，但在絨山羊生產實際中沒有可操作性；外源補充rhKGF-2在動物體內存留量和存留時間決定了其發揮效果的顯著性。本研究主要探討rhKGF-2不同方式和不同劑量對絨山羊體內KGF-2濃度的影響，期望篩選出適宜的劑量參數和合適的給藥方法，實現一次性給藥使動物體內KGF-2濃度維持較長時間，為后續研究KGF-2調控絨山羊絨毛生長提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗動物來自遼寧省遼寧絨山羊原種場，選擇24只5~7月齡、體重為（26.95±1.87）kg的遼寧絨山羊，公母各半，隨機分為4組，每組6只羊。試驗設計與各處理體重見表1。

表1 試驗設計與各處理體重Tab.1 Design of experiment and body weight of each treatment單位：kg

試驗1組皮下注射rhKGF-2膠原蛋白溶液，試驗2組皮下注射rhKGF-2溫敏感凝膠溶液，試驗3組皮下注射rhKGF-2生理鹽水溶液；試驗4組為對照，不做KGF-2處理。本試驗設3個周期，每個周期18 d，依次給予低、中、高等3個劑量[9-10]處理，分別為每只羊每日10、20、30μg/kg。

1.2 試劑及制備方法

本試驗所使用的rhKGF-2購自成都云希化工有限公司，純度為95%。膠原蛋白粉和溫敏感凝膠購自沈陽鼎國生物科技公司。

1.2.1 rhKGF-2膠原蛋白溶液的制備

在無菌操凈臺下，分別稱量5 mg和55 mg的rhKGF-2和膠原蛋白粉[11]于滅菌的10 mL離心管中，加入溫度為15~18℃的滅菌超純水6 mL，玻璃棒攪動，渦旋振蕩器振蕩3~5 min，KGF-2和膠原蛋白粉充分混勻，達到靜止30 min后不分層的狀態。將溶液分裝于1.5 mL離心管中，-20℃保存。

1.2.2 rhKGF-2溫敏感水凝膠溶液的制備

溫敏感水凝膠制備方法參照Chen等[12]的冷溶法。

在無菌操凈臺下，稱量2.2 g溫敏感凝膠于滅菌的10 mL離心管中，加入溫度為4℃的滅菌超純水6 mL，玻璃棒攪動，振蕩器振蕩5~10 min，溫敏感凝膠充分混勻，無氣泡和小的凝膠顆粒。在操作過程中利用冰塊間斷性地對離心管降溫，4℃條件下靜置過夜，形成透明溶液。稱量5 mg的rhKGF-2加入離心管的溶液，再次振蕩混合，達到充分混勻、完全溶解、無氣泡、無顆粒、不分層的狀態，分裝，0~4℃保存。

1.2.3 rhKGF-2生理鹽水溶液的制備

在無菌操凈臺下，分別稱量rhKGF-2和滅菌生理鹽水5 mg和11 mL于滅菌的15 mL離心管中，渦旋振蕩器振蕩5~8 min，使溶液完全混勻。分裝保存同1.2.1。

1.3 試驗方法

試驗當日上午，試驗動物稱重。14：30各組試驗動物分別于左側頸部皮下注射，注意將溫敏凝膠試劑管始終放置于0~4℃左右的低溫盒中取用。

1.4 測定指標及方法

在試驗處理前以及處理后6、18、42、90、138、210、258、354、426 h，分別采集試驗羊靜脈血5 mL，3 500 r/min離心15 min，制備血清，分裝至1 mL離心管，-20℃冷凍保存。采用ELASA法，應用華衛德朗DR-200BS酶標分析儀測定絨山羊血清KGF-2水平。

1.5 數據統計與分析

采用Excel 2010軟件處理原始數據，SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA），Duncan's法進行多重比較。結果以“平均值±標準差”表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同劑量rhKGF-2處理下絨山羊血清KGF-2濃度的變化

2.1.1 低劑量rhKGF-2處理下絨山羊血清KGF-2濃度的變化（見表2）

由表2可知，3個試驗組血清KGF-2濃度均隨著時間推移呈先增加后降低的趨勢，對照組未發生顯著波動。試驗處理6 h后，3個試驗組血清KGF-2濃度均顯著高于對照組（P<0.05）。處理18 h后，3個試驗組血清KGF-2濃度均極顯著高于對照組（P<0.01）。處理42 h后，3個試驗組血清KGF-2濃度均極顯著高于對照組（P<0.01），同時試驗1組顯著高于試驗3組（P<0.05）。

表2 低劑量rhKGF-2處理下絨山羊血清KGF-2濃度的變化Tab.2 Changesof serum KGF-2 concentration in Cashmere goatstreated with low-doserhKGF-2 單位：ng/L

處理90 h后，試驗1組和試驗2組血清KGF-2濃度均極顯著高于試驗3組和對照組（P<0.01）。處理138 h后，試驗1組血清KGF-2濃度極顯著高于對照組（P<0.01），并顯著高于試驗3組（P<0.05），試驗2組極顯著高于試驗3組和對照組（P<0.01）。處理210 h及之后，各試驗組血清KGF-2濃度差異均不顯著（P>0.05）。

從處理前到處理后258 h，3個試驗組均在試驗處理后42 h達到高峰，其后逐步降低，對照組隨著時間推移血清KGF-2濃度無顯著的變化。從血清KGF-2濃度絕對值看，試驗1組和試驗2組在各時間點均略高于試驗3組，3個試驗組在此期間均高于對照組。

2.1.2 中劑量rhKGF-2處理下絨山羊血清KGF-2濃度的變化（見表3）

由表3可知，各試驗組血清KGF-2濃度均呈先增加后降低的趨勢，對照組未發生顯著波動，濃度比較平穩。在試驗處理6~42 h后，3個試驗組血清KGF-2濃度均極顯著高于對照組（P<0.01）。處理90 h后，試驗1組和試驗2組血清KGF-2濃度極顯著高于對照組（P<0.01），試驗3組顯著高于對照組（P<0.05）。

表3 中劑量rhKGF-2處理下絨山羊血清KGF-2濃度的變化Tab.3 Changes of serum KGF-2 concentration in Cashmeregoats treated with middle-dose rhKGF-2 單位：ng/L

處理138 h后，試驗1組血清KGF-2濃度極顯著高于試驗3組和對照組（P<0.01）；試驗2組顯著高于試驗3組（P<0.05），并極顯著高于對照組（P<0.01）；試驗3組高于對照組，但差異不顯著（P>0.05）。在處理210~258 h后，試驗1組和試驗2組血清KGF-2濃度極顯著高于試驗3組和對照組（P<0.01）；試驗3組與對照組差異不顯著（P>0.05）。試驗處理后354 h后，各組間差異均不顯著（P>0.05）。

從處理前到處理后426 h，試驗1組血清KGF-2濃度在試驗處理后138 h達到高峰，試驗2組則在90 h達到高峰，試驗3組在42 h后達到高峰，其后各組均降低；其中試驗1組和2組呈近似拋物線形式下降，但試驗3組濃度呈近似直線形式急劇下降。對照組隨著時間推移血清KGF-2濃度無顯著的變化。從血清KGF-2濃度絕對值看，試驗1組和試驗2組在各時間點明顯高于對照組，同時試驗1組總體上高于試驗2組，試驗3組自210 h后，與對照組基本無顯著差異。

2.1.3 高劑量rhKGF-2處理下絨山羊血清KGF-2濃度的變化（見表4）

由表4可知，各試驗組血清KGF-2濃度均呈現隨著時間推移先增加后降低的趨勢，對照組血清KGF-2濃度未發生顯著波動。試驗處理6~18 h后，3個試驗組血清KGF-2濃度均極顯著高于對照組（P<0.01），同時試驗3組顯著高于試驗1組和2組（P<0.05）。在試驗處理后42 h后，3個試驗組血清KGF-2濃度均極顯著高于對照組（P<0.01）。試驗處理90~138 h后，試驗1組和2組極顯著高于試驗3組和對照組（P<0.01），試驗3組極顯著高于對照組（P<0.01）。

表4 高劑量rhKGF-2處理下絨山羊血清KGF-2濃度的變化Tab.4 Changesof serum KGF-2 concentration in Cashmeregoatstreated with high-doserhKGF-2 單位：ng/L

試驗處理210 h后，試驗1組極顯著高于其他組（P<0.01），試驗2組極顯著高于試驗3組和對照組（P<0.01）。試驗處理258~354 h后，試驗1組和2組極顯著高于試驗3組和對照組（P<0.01）。試驗處理426 h后，試驗1組顯著高于試驗3組和對照組（P<0.01），試驗2組極顯著高于試驗3組和對照組（P<0.05）。自處理210 h后，試驗3組與對照組差異不顯著（P>0.05）。

按照時間軸來對比，試驗1組血清KGF-2濃度在試驗處理后138 h達到高峰，試驗2組則在90 h達到高峰，試驗3組為42 h達到高峰，其后逐步降低，對照組隨著時間推移血清KGF-2濃度無顯著的變化。從血清KGF-2濃度絕對值看，試驗1組和試驗2組在各時間點均明顯高于對照組。

2.2 各處理方式下絨山羊血清KGF-2濃度的變化

2.2.1 膠原蛋白溶液處理方式下絨山羊血清KGF-2濃度的變化（見圖1）

由圖1可知，隨著注射劑量增加，血清中KGF-2的峰值出現時間由42 h逐漸延后至138 h；從各個時間點的血清KGF-2的絕對值看，提高注射劑量可使血清KGF-2濃度增加、延長血清KGF-2高水平維持時間。

圖1 膠原蛋白溶液處理方式下絨山羊血清KGF-2濃度的變化Fig.1 Changesof serum KGF-2 concentration in Cashmere goatstreated with collagen solution

2.2.2 溫敏感凝膠溶液處理方式下絨山羊血清KGF-2濃度的變化（見圖2）

由圖2可知，檢測到隨著劑量的增加，血清KGF-2濃度高峰出現時間由18 h順延至90 h；在42 h后，增加處理劑量可使血清KGF-2濃度增加；提高處理劑量可使血清KGF-2高濃度（高于對照組）維持時間增加至426 h。

圖2 溫敏感凝膠溶液處理方式下絨山羊血清KGF-2濃度的變化Fig.2 Changes of serum KGF-2 concentration in Cashmeregoats treated with temperature-sensitivegel solution

2.2.3 生理鹽水溶液處理方式下絨山羊血清KGF-2濃度的變化（見圖3）

由圖3可知，低劑量rhKGF-2生理鹽水溶液皮下注射，在處理18 h后，血清KGF-2濃度即開始斷崖式降低，在138 h接近于試驗前水平和對照組水平；中劑量試驗和高劑量試驗表明，在處理42 h后血清KGF-2濃度達到最高峰，之后呈迅速下降，138~210 h即下降至試驗前或對照組水平。

圖3 生理鹽水溶液處理方式下絨山羊血清KGF-2濃度的變化Fig.3 Changes of serum KGF-2 concentration in Cashmeregoats treated with normal salinesolution

3 討論

KGF-2對皮膚組織損傷修復[13]和毛囊發育具有重要影響[6]，研究其對絨山羊毛囊發育的作用在生產中具有極大的意義。外源補充rhKGF-2對絨山羊毛囊發育的作用要依靠體內持續的高濃度KGF-2水平，其作用效果主要受給藥方式和給藥劑量的影響。

3.1 不同劑量rhKGF-2處理下絨山羊血清KGF-2濃度的變化

在相同劑量下，以膠原蛋白溶液、溫敏感凝膠和生理鹽水方式給絨山羊補充rhKGF-2，均可使血清KGF-2濃度先升高而后緩慢下降。

低劑量補充rhKGF-2后，3種處理的絨山羊血清KGF-2濃度在42 h即達到頂峰，而后下降，至240 h左右與對照組相近。中劑量組在138 h前達到頂峰，之后開始下降，至408 h左右與對照組相近。高劑量組則在426 h仍高于對照組。因此，從絨山羊血清KGF-2高濃度維持時間看，高劑量組更適宜。

3.2 不同rhKGF-2處理方式下絨山羊血清KGF-2濃度的變化

3.2.1 膠原蛋白溶液處理方式下絨山羊血清KGF-2濃度的變化

在膠原蛋白溶液給藥方式下，不同處理劑量對血清KGF-2的濃度和維持時間均具有一定影響，本研究設置的低、中、高3個劑量分別為10、20、30μg/kg，主要參考宗英[9]和鄭杰民等[10]的毒性試驗研究得出的KGF-2安全劑量以及王澤等[4]對試驗禿毛大鼠每日涂抹給藥劑量而設計。利用膠原蛋白作為rhKGF-2的載體可以制作成具有緩釋作用的制劑，蔡敏倩[11]以豬皮為原料提取出膠原蛋白，并以此膠原蛋白為原料與KGF-2復合制作成了KGF-2生物蛋白復合海綿，該復合物能在25℃和37℃下穩定保存6個月，經過測定其KGF-2可緩慢釋放14 d，釋放量為51.33%。

本研究利用膠原蛋白作為骨架材料制成rhKGF-2膠原蛋白溶液，通過皮下注射進遼寧絨山羊體內。注射不同劑量rhKGF-2膠原蛋白溶液后發現，隨著注射劑量增加，血清中KGF-2的峰值出現時間從42 h逐漸延后到138 h，從各個時間點的血清KGF-2的絕對值看，提高注射劑量可使血清KGF-2濃度增加、延長血清KGF-2高水平維持時間。

3.2.2 溫敏感凝膠溶液處理方式下絨山羊血清KGF-2濃度的變化

溫敏感水凝膠是一類具有溫敏感特性的智能高分子材料[14-15]，可以吸收并保留大量水而維持其三維網絡結構，能夠應對環境的改變產生智能性響應，是人醫載藥系統中一類特殊的載體[16]，常利用溫敏感水凝膠制作成微囊給藥[17],從而達到緩釋效果。本試驗所采用的溫敏感凝膠是N-異丙基丙烯酰胺（NIPAM）是熱縮溫敏水凝膠的一種，在低溫下該凝膠溶于水中形成液態凝膠；當溫度高于32~35℃時，則聚合形成聚N-異丙基丙烯酰胺（PNIPAM）的固態凝膠。該聚合物可形成網絡結構，可作為藥物緩釋載體[18]。利用溫敏感材料做KGF-2緩釋載體可以產生延緩KGF-2釋放速度的作用[19]，生長因子和合適的載體材料組合可以防止蛋白酶水解，有效保護和緩慢釋放生長因子[20]。付文亮等[21]曾利用殼聚糖、殼聚糖季銨鹽等配制成溫敏感材料與KGF-2復合，形成一種敷料，其KGF-2的蛋白活性可基本保持穩定，并具有一定的緩釋效果。

本試驗將KGF-2在4℃下與NIPAM溶解制成溶液，注射到試驗絨山羊皮下。由于羊的體表溫度高于32℃，即可形成PNIPAM，KGF-2存在于凝膠網絡中即可發揮緩釋效果。本試驗皮下注射了低、中、高等3個劑量的rhKGF-2，結果顯示，隨著劑量的增加，血清KGF-2濃度高峰出現時間由18 h順延至90 h；在處理42 h后，增加處理劑量可提高血清KGF-2濃度；提高處理劑量可使血清KGF-2高濃度（高于對照組）維持時間增加至426 h。

3.2.3 生理鹽水溶液處理方式下絨山羊血清KGF-2濃度的變化

生理鹽水是動物給藥常用的溶劑。本研究發現，低劑量rhKGF-2生理鹽水溶液皮下注射18 h后，血清KGF-2濃度即開始斷崖式降低，在138 h接近于試驗前水平和對照組水平；中計量試驗和高劑量試驗表明，在42 h時，血清KGF-2濃度達到最高峰，之后呈迅速下降，138~210 h即下降至試驗前或對照組水平。由此可知，用生理鹽水溶液注射給藥后羊體內rhKGF-2快速吸收、快速代謝分解，無法持續發揮作用，此方式在生產實際中的可操作性不強，應用的局限性較大。

綜上可知，提高rhKGF-2的劑量均增加了試驗絨山羊血清KGF-2的濃度，使血清KGF-2峰值延時出現，使血清KGF-2高濃度（高于對照組）維持時間延長至426 h。合適的緩釋時間是rhKGF-2調控羊的絨毛生長在生產中能否施行的關鍵；本研究發現，給予30μg/kg的劑量可使緩釋時間達到接近18 d，效果較為理想。

對比膠原蛋白和溫敏感凝膠這兩種處理方式發現，二者對KGF-2的延時釋放效果相似，且各具優勢。膠原蛋白溶液方式處理后血清KGF-2濃度更高，溫敏感凝膠處理后羊血清KGF-2濃度在峰值之后下降更平緩；但rhKGF-2溫敏感凝膠溶液制作過程中要求在低溫條件下操作，否則凝膠不易溶解，比膠原蛋白方式操作復雜。

綜上所述，在本研究條件下認為，采用KGF-2膠原蛋白溶液更合適。

4 結論

按照30μg/（kg·d）的劑量配制KGF-2膠原蛋白溶液皮下注射絨山羊后，絨山羊的血清KGF-2濃度在138 h達到高峰，血清KGF-2高濃度（高于對照組）維持時間可達426 h。因此，本試驗條件下rhKGF-2的適宜補充劑量為30μg/kg，合適的給藥處理方式是膠原蛋白溶液。