雞腸炎沙門氏菌噬菌體的分離與生物學特性研究

高 瑤，曹祁峰，周鐵忠，李 冰*

（1.錦州醫科大學畜牧獸醫學院，遼寧 錦州 121001；2.遼寧益康生物股份公司，遼寧 遼陽 111000）

沙門氏菌（Salmonella）是一種常見的人畜共患病病原菌，尤其是腸炎沙門氏菌（Salmonellaenteritidis）對蛋類、肉類、奶類等食品污染率極高[1]。我國由細菌引起的食源性疾病中，沙門氏菌疾病占70%以上[2]。抗生素藥品廣泛應用導致出現多重耐藥菌，使抗生素的治療效果逐漸降低。因此，如何應對多重耐藥菌感染成為新的研究重點。

噬菌體是一種以細菌作為宿主的病毒，通過吸附并感染細菌，在其內部增殖并通過釋放酶類物質裂解細菌。噬菌體只針對特定的病原菌，并且在特定部位進行裂解作用，對其他種、型不發揮作用[3]，噬菌體隨著致病菌的死亡而減少直至消失。因此，特異性的噬菌體一般不會影響正常菌群。此外，細菌耐藥性無法影響噬菌體；根據相關數據分析，抗菌藥物使細菌產生耐藥性的突變頻率為10-5，而噬菌體使細菌產生抗性的突變頻率為10-7。雖然細菌也會對噬菌體產生抗性，但噬菌體可以隨著細菌的生長而進化，以此抵抗細菌產生的抗性[4-5]。據統計，全球目前約有28家生產噬菌體相關產品的公司，除李斯特菌噬菌體產品外，沙門氏菌噬菌體產品數量占據第一[6]。噬菌體療法作為一種新興的治療方式，具有殺菌效果強、利用率高、特異性高、殺滅細菌的閾值低等優點，臨床應用更具優勢[7]。本試驗從錦州某雞場糞便中分離到的1株雞腸炎沙門氏菌噬菌體，并對其進行生物學特性研究，為噬菌體制劑防治雞腸炎沙門氏菌感染的研究與應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所采用雞腸炎沙門氏菌錦州醫科大學畜產品質量與安全重點實驗室保存和提供。糞便樣品采集于錦州市某規模化蛋雞場。

1.2 試劑與儀器

主要試劑：LB培養基（液體）、營養肉湯（NB）、LB培養基（固體）、伊紅美藍培養基、雙層瓊脂培養基（上層為液體LB培養基加0.7%的瓊脂粉，下層為固體LB培養基）按常規說明方法配制。微孔濾膜（0.22μm）、無菌PBS緩沖液、病毒基因組DNA/RNA快速提取試劑盒，均購自索萊寶生物技術（北京）有限公司；Taq 2×Mix購自生工生物工程技術服務（上海）有限公司。

主要儀器：電熱恒溫培養箱（上海精宏實驗設備有限公司）、高速離心機（Sigma公司）、恒溫震蕩培養箱（上海捷呈實驗儀器有限公司）、瓊脂糖電泳儀（南京昕儀生物科技有限公司）、凝膠成像分析系統（上海速科實業有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌懸液的制備

取-80℃保存的雞沙門氏菌，加入等體積生理鹽水稀釋，接種于LB培養基，37℃培養6 h。接種于伊紅美藍培養基，37℃培養18 h。取單個菌落重新接種于LB培養基，37℃，200 r/min振蕩培養6 h，制成菌懸液。

1.3.2 裂解液的制備

取糞便樣品30 g，加入100 mL生理鹽水與氯仿的混合液，充分攪拌混勻，紗布將樣品粗濾后，自然沉降4 h，12 000 r/min離心10 min，取上清液經微孔濾膜（0.22μm）過濾，重復離心處理3次獲得初濾液。

取5 mL初濾液加入10 mL LB培養液中充分混勻，加入100μL宿主菌，37℃的恒溫環境下振蕩培養14 h，采集增殖后的培養液，12 000 r/min離心5 min，取上清液經微孔濾膜（0.22μm）過濾，獲得裂解液，做無菌檢測[8]。

1.3.3 確證試驗

通過斑點法對裂解液進行確證試驗。取150μL菌懸液均勻涂布于LB瓊脂平板上，滴加20μL裂解液于平板上。觀察是否有無色透明的噬菌斑生成，若有則證明裂解液中含有沙門氏菌噬菌體。

1.3.4 噬菌體的純化

對噬菌體進行純化主要方式為雙層平板法。加入無菌PBS緩沖液對噬菌體裂解液進行10倍稀釋，取100μL稀釋后的裂解液與100μL菌懸液混合均勻，加入50℃恒溫的7 mL LB半固體瓊脂培養基中再次混合均勻，快速倒入預先制備好的LB固體瓊脂平板上，無菌環境下靜置20 min等待凝固，37℃恒溫培養18 h，觀察噬菌斑情況。

選取直徑較大、清澈透亮的噬菌斑，碾碎后置于含有1 mL無菌PBS緩沖液的無菌EP管中，4℃恒溫靜置2 h，進行離心過濾處理，適當稀釋后重復上述操作。采用雙層平板法純化噬菌體，直至噬菌斑形狀和大小一致，即得純化的噬菌體。

1.3.5 噬菌體效價的測定

取純化后的噬菌體溶液100μL，加入900μL無菌PBS緩沖溶液，分別稀釋至10-1~10-10，采用雙層平板法測定噬菌體的滴度，試驗重復3次，取平均值。

1.3.6 PCR鑒定與產物測序

參照GenBank中公布的腸炎沙門氏菌噬菌體epsilon15（NC_004775）的衣殼蛋白設計特異性引物[9]：上游引物5'-CAAACCCAGACCGTACCAGT-3'，下游引物5'-AACGATCTTCTTGCCGCCGTA-3'。

根據病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說明書提取噬菌體基因組，按常規說明方法進行反轉錄，通過PCR方法對基因序列進行擴增，退火溫度條件為57℃，獲得大小為784 bp的產物片段。

根據膠回收試劑盒操作說明方法進行將目的條帶進行回收，將目的基因與pMD18-T載體相連，連接產物轉化DH5α感受態細胞。挑取單個菌落，接種于含青氨芐霉素（100 mg/L）的LB液體培養基中，37℃恒溫振蕩培養過夜。利用質粒小提試劑盒對質粒進行提取，經過PCR檢驗，陽性重組質粒送生工生物工程股份公司測序，每個陽性質粒測序3次以確保基因序列的準確性[10]。

1.3.7 基因序列遺傳進化分析

本研究選擇GenBank數據庫中的29株沙門氏菌噬菌體作為參考噬菌體，為進行序列比對及核苷酸序列同源性分析，采用了DNAStar7.1軟件中MegAlign程序的ClustalW方法，利用MEGA7.0軟件中Neighbor-Joining方法生成了目的基因序列的系統發育進化樹[11]。

1.3.8 熱穩定性的測定

取100μL噬菌體純培養液轉移至無菌EP管，分別置于不同溫度下（30、40、50、60、70、80℃）水浴，作用30、60 min。結束后立即取出EP管，置于冰浴中冷卻，通過雙層平板法對噬菌體效價進行測定，進行3次重復試驗[12]。

1.3.9 pH值敏感性的測定

取100μL噬菌體純培養液分別接種于pH值為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14的LB培養基中，37℃恒溫培養12 h，通過雙層平板法對噬菌體效價進行測定，進行3次重復試驗[13]。

2 結果與分析

2.1 噬菌體的分離與純化與效價測定

從錦州地區某雞場糞便樣品中分離純化得到1株沙門氏菌噬菌體，并命名為SP-1。

采用雙層平板法純化該噬菌體，噬菌斑呈透亮的空斑，大而清晰，直徑為4~7 mm，見圖1。根據公式計算，噬菌體SP-1效價為8.25×108PFU/mL。

圖1 噬菌體SP-1的噬菌斑Fig.1 Plaquesof bacteriophage SP-1

2.2 RT-PCR擴增與測序（見圖2、圖3）

由圖2可知，應用本試驗設計的特異性引物對噬菌體基因組進行PCR擴增，PCR擴增產物大小約784 bp，與預期片段大小一致。

圖2 噬菌體SP-1擴增結果Fig.2 Result of bacteriophage SP-1 amplification

PCR擴增產物測序，獲得784 bp，5'端與3'端均有完整的引物序列（條框部分），見圖3。

圖3 PCR產物測序結果Fig.3 PCRproduct sequencing result

2.3 基因序列遺傳進化分析（見圖4、圖5）

圖4 目的基因遺傳進化樹Fig.4 Genetic evolution treeof target genes

圖5 同源性對比分析Fig.5 Comparativeanalysis of homology

由圖4可知，噬菌體SP-1與參考的腸炎沙門噬菌體為同一分支。

由圖5可知，噬菌體SP-1與腸炎沙門氏菌噬菌體同源性均在89.5%~99.5%之間。綜上所述，可判定噬菌體SP-1屬于腸炎沙門氏菌噬菌體。

2.4 噬菌體SP-1熱穩定性與pH值敏感性的測定（見圖6、圖7）

由圖6可知，噬菌體效價在各溫度下分別作用30和60 min時差異水平不顯著（P>0.05），作用30 min效價略高。在30~50℃的溫度下，效價下降趨勢緩慢；60℃時下降迅速；70℃之后效價下降至0。

圖6 噬菌體SP-1對溫度的耐受力Fig.6 Temperaturetolerance of phage SP-1

由圖7可知，噬菌體效價在pH值5~11之間較為穩定。當pH值低于5或大于11時效價水平明顯降低；當pH值低于2或高于13時效價為0，表明噬菌體無法存活。

圖7 噬菌體SP-1對pH值的耐受力Fig.7 pH valuetoleranceof phage SP-1

3 討論

噬菌體于1915年首次被發現并應用于細菌疾病的治療，然而隨著抗生素的發現與應用，噬菌體的研究停滯不前[14]。因抗生素的肆意濫用導致細菌耐藥性問題日益凸顯，噬菌體制劑成了一個新的研究方向。噬菌體是自然界中種類最多的病毒，各類細菌均能夠找到與之對應的裂解性噬菌體。噬菌體具有高度特異性，只感染特定種屬的病原菌，在細菌內部快速增殖并使之裂解，不會破壞正常菌群，更不會對周圍環境產生影響，故可將噬菌體應用于環境消毒。腸炎沙門氏菌是目前養殖場普遍存在且污染最嚴重的細菌之一，對腸炎沙門氏菌噬菌體的發現及研究非常重要。

噬菌體的專一性、高度特異性、無耐藥性等優點在臨床應用上前景廣闊[15-16]。江艷華等[17]分離得到1株沙門菌噬菌體，并對其進行生物學特性分析；結果發現，該噬菌體具有較好的溫度耐受性并且能夠逐漸降低宿主菌數目。噬菌體感染細菌的首要過程是吸附細菌，噬菌體的吸附率受到溫度及pH值的影響。在最適溫度下，噬菌體吸附率能夠達到峰值，溫度過高或過低均可導致吸附率下降。pH值的高低直接影響噬菌體吸附器官及其宿主菌表面受體的分子結構和互補性[18]。因此，篩選出最適溫度及pH值是噬菌體能否高效滅菌的直接因素。

臨床應用上，可考慮將噬菌體作為生物抑菌劑進行沙門氏菌的防控，或采用與其他抗菌制劑聯合應用的方式提高抑菌效果，為噬菌體應用于活體動物細菌疾病的治療以及食源性沙門氏菌疾病的生物防控提供了前提條件[19]。

根據目前形勢需要，噬菌體制劑還可應用于治療細菌疾病以及細菌的檢測。噬菌體不受耐藥性限制、副作用小、無殘留，安全性已得到驗證，比抗生素更適合應用于臨床治療。目前利用抗體檢測細菌準確性高但速度慢，噬菌體具有嚴格的特異性，能夠快速且高效地選擇對應的細菌。裂解菌體通過釋放胞內酶類進行安培計測量，從而確定病原菌[20]。噬菌體制劑發展前景可觀，雖然目前噬菌體制劑臨床應用較少，但噬菌體的潛在優勢仍是殺滅細菌最好的方式。隨著生物技術不斷成熟，噬菌體的研究將逐步完善，克服弊端，擴大優勢，噬菌體制劑將會成為一種理想的新型抗菌制劑。

4 結論

本試驗從錦州地區某雞場糞便樣品中分離純化得到1株腸炎沙門氏菌噬菌體SP-1，該噬菌體效價為8.25×108PFU/mL，對腸炎沙門氏菌具有良好的裂解性能。生物學特性測定結果顯示，噬菌體SP-1對溫度以及pH值具有較寬泛的耐受力，表明其具備作為治療雞腸炎沙門氏菌噬菌體制劑候選毒株的潛在應用價值。