陰性切緣胃腸道間質瘤患者C-kit基因突變特征與術后復發的關系*

徐康，胡磊，朱志強，徐皓

(1.蚌埠醫學院 研究生院，安徽 蚌埠 233000；2.中國科學技術大學附屬第一醫院 普外科，安徽 合肥 230031；3.六安市人民醫院 普外科，安徽 六安 237005)

胃腸道間質瘤(gastrointestinal stromal tumors,GIST)是一種主要來源于Cajal間質細胞(interstitial cells of Cajal,ICC)的間葉性腫瘤，ICC作為胃腸道起搏細胞，調控胃腸道節律性運動[1]。GIST好發于胃和小腸，中老年患者多發，每年發病率10～20/100萬，且隨著常規胃腸鏡和膠囊胃鏡的廣泛應用，發病率逐年升高[2]。手術切除聯合規律靶向治療是目前治療GIST的首選[3]。2008年，以伊馬替尼(imatinib,IM)為代表的酪氨酸激酶抑制劑被批準應用于GIST的治療中[4]。有研究顯示，GIST患者行手術治療后約10%術后出現復發[5]；鞠雷[6]研究認為GIST患者術后復發與根治程度相關，未達到陰性切緣(negative resection margins,R0)是GIST復發的獨立危險因素，但目前對于R0術后患者復發的相關因素暫未明確。絕大多數GIST患者存在原癌基因酪氨酸蛋白激酶kit(proto-oncogene tyrosine-protein kinasekit,C-kit)突變，這一突變在GIST疾病進程中扮演重要角色[7]。已有研究指出C-kit突變與GIST惡性程度及復發密切相關[8]。國內外關于C-kit突變類型與R0切除GIST患者術后復發研究較少，本研究收集了C-kit突變和R0切除GIST患者臨床資料，探討C-kit突變特征與GIST術后復發的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2013年1月—2018年6月收治的GIST患者作為研究對象，要求符合：(1)組織病理學確診為GIST；(2)年齡40～80歲，初診，未接受其他治療；(3)基因突變檢測明確有C-kit突變；(4)無遠處轉移；(5)行R0手術切除。排除標準：(1)嚴重的肝腎功能不全者；(2)嚴重心肺功能障礙且不能耐受手術者；(3)合并其他惡性腫瘤者；(4)精神異常或不能堅持配合隨訪者。共納入GIST患者66例，男42例、女24例，年齡42～80歲、平均(61.26±9.89)歲。本研究特別詳細向患者及家屬闡述GIST及瘤體組織取出流程，經同意后簽署知情同意書，并獲醫院人體實驗倫理委員會批準(批準號PJ2020-007)，嚴格遵守《赫爾辛基宣言》。

1.2 研究方法

1.2.1一般臨床資料 收集患者的姓名、住院號及臨床病理特征，后者包含年齡、性別、原發部位、腫瘤最大徑、核分裂像數目、瘤體破裂、簇分化抗原117(cluster of differentiation,CD117)、胃腸道間質瘤1的標記物(discovered on gastrointestinal stromal tumors 1,DOG1)、簇分化抗原34(cluster of differentiation 34,CD34)、增殖標記蛋白Ki-67(proliferation marker protein Ki-67,Ki-67)、危險度分級、腫瘤淋巴結轉移(tumor node metastasis,TNM)分期、C-kit突變類型、手術方式及術后靶向治療情況。

1.2.2臨床指標檢測 根據實際情況選擇傳統開腹或腹腔鏡手術方式后切除腫瘤，瘤體及瘤體周圍組織離體后送至病理科制備組織蠟塊，進行常規術后病理檢測、C-kit突變類型及突變位點檢測。根據《胃腸間質瘤基因檢測與臨床應用的中國專家共識(2021版)》，采用第一代Sanger測序法進行檢測，檢測的位點是C-kit突變的熱點區域，即外顯子9、11、13及17號[9]。首先利用AmoyDx FFPE DNA試劑盒(廈門艾德生物醫藥有限公司)從組織蠟塊中提取DNA，再利用引物將上述突變位點擴增；使用BigDye Terminator v1.1試劑盒(Applied Biosystems)對聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)產物進行測序，采用3500/xl遺傳測序儀(Applied Biosystems)進行突變分析；參考文獻[10]方法進行引物設計。引物序列見表1。

表1 C-kit的引物序列

1.2.3術后靶向治療 GIST患者術后初始IM治療量400 mg/d，根據外顯子突變類型制定個體化方案。采用改良美國國立研究院(National Institutes of Health，NIH)標準評估危險度，包括腫瘤最大徑、核分裂像計數及原發部位，對GIST危險度進行分級[11]。GIST中度風險因素患者至少予IM治療1年，高度危險因素的GIST患者至少予IM治療3年，發生瘤體破裂者酌情延長IM治療時間，C-kit外顯子9突變的GIST患者依據對IM的耐受程度推薦術后輔助治療800 mg/d、無法耐受適當減量至400 mg/d、遵醫囑規律服用，R0術后患者初次復發則予以停藥[12]。

1.2.4隨訪及術后復發確定 低危患者每6個月隨訪1次，中高危患者每3個月隨訪1次，截止時間為2021年6月；隨訪內容包括腹部電子計算機斷層掃描(computed tomography,CT)或磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)檢查，評估是否復發[13]，計算3年無病生存期(disease-free survival，DFS；同時以患者R0手術日作為起點，直到腫瘤初次復發為止[14])。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 術后療效情況

66例GIST患者術后失訪6例；60例隨訪GIST患者均為持續服藥，服藥時間6～36個月，平均21個月，復發31例(肝臟轉移7例、腹腔轉移5例)、無復發者29例，3年DFS為48.3%。

2.2 GIST患者C-kit突變類型分布

66例GIST患者C-kit外顯子突變類型中，11號外顯子突變50例(75.76%)，9號外顯子8例(12.12%)，13號外顯子5例(7.57%)，17號外顯子3例(4.55%)；所有突變類型中缺失突變發生頻率最高，為38例(57.58%)，其余依次是點突變19例(28.79%)、重復突變5例(7.57%)、插入突變2例(3.03%)、混合突變2例(3.03%)。見表2。

表2 GIST患者的C-kit突變類型構成

2.3 GIST患者3年DFS的單因素分析

單因素分析結果中，腫瘤最大徑、核分裂像計數、瘤體破裂、Ki-67增值指數、NIH分級、TNM分期、C-kit突變類型與術后3年DFS有相關性(P<0.05)，與性別、年齡、腫瘤原發位置、CD117、DOG1、CD34、手術方式無相關性(P>0.05，表3)。

表3 GIST患者R0切除術后3年DFS的單因素分析[n(%)]

2.4 GIST患者R0切除術后3年DFS的多因素Cox回歸分析

對單因素中與術后3年DFS相關的因素進行Cox回歸模型分析，腫瘤最大徑≥5 cm、核分裂像計數≥5個/50高倍視野、瘤體破裂、Ki-67增值指數≥5、中高危NIH分級、TNM分期Ⅱ和Ⅲ期、C-kit的9、11號外顯子突變類型是GIST患者術后3年內復發的獨立危險因素(P<0.05)。見表4和表5。

表4 GIST患者 R0切除術后3年DFS影響因素變量的賦值

表5 GIST患者R0切除術后3年DFS的多因素Cox回歸分析

2.5 生存分析

GIST患者隨訪3年，C-kit外顯子突變類型中9號、11號、13號及17號外顯子的3年DFS分別為37.50%、52.00%、80.00%及100%；C-kit不同的突變位點中，點突變、缺失突變、重復突變、插入突變和混合突變的3年DFS分別為75.11%、38.98%、75.00%、100%及100%。見圖1。

圖1 C-kit不同外顯子突變類型和突變位點GIST患者的3年DFS

3 討論

GIST是一類起源于肌間叢區域的間葉組織細胞腫瘤。GIST患者主要以C-kit或血小板衍生生長因子受體(platelet-derived growth factor receptor alpha,PDGFRA)突變為主，少數出現其他突變[如野生型胃腸道間質瘤(wild-type gastroinestinal stromal tumors,WT-GIST)][15]。C-kit是一種編碼長度約145 kDa的原癌基因，也是一種具有酶活性的跨膜蛋白受體[16]。C-kit由2個主要區域構成，受體調節域(細胞外區、跨膜區和膜旁區)的二聚化結構域和胞內具有激酶活性結構域組，而后者是IM的作用靶點[17]。

突變以錯義突變、插入或缺失的形式影響C-kit外顯子[18]。本研究結果顯示，外顯子突變頻率由低到高依次為外顯17、13、9、11，同時又以缺失突變頻率最高，基本符合現有文獻結果[19]。本結果顯示，9、11號外顯子突變是GIST患者術后3年內復發的獨立危險因素(P<0.05)，提示C-kit外顯子突變類型可用作判斷GIST復發的重要生物學指標。當C-kit基因突變后，其激活不受調節，引起相應的信號轉導系統功能失調，進而細胞發生異常增殖，細胞凋亡受到抑制，最終發展為惡性腫瘤[20]。其機制可能為干細胞因子與細胞外的二聚體結合，誘導絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase,PI3K)通路的受體二聚化、磷酸化，膜旁區起到穩定結構非活性構象和二聚化作用，進而導致膜旁區結構域功能異常的突變亦可導致二聚化和自磷酸化[21]。有研究認為，C-kit基因突變特征與GIST惡性程度及預后有密切關系，C-kit突變在高度惡性的GIST中多見，與C-kit突變陰性的患者對比，發生腫瘤侵襲鄰近組織、轉移及復發的可能性更大[22]。此外，也有研究結果顯示，11號外顯子突變比9號外顯子突變、無突變者、PDGFRA突變的中位DFS時間顯更長[23]。本研究中不同C-kit突變類型與3年DFS曲線得知，外顯子11的3年DFS優于外顯子9，符合現有文獻報道。但因本研究納入的外顯子13及17突變樣本量較少，導致兩者3年DFS優于外顯子9、11，或對結果造成影響，因此未來需要更多樣本驗證結論。當臨床指導GIST合理用藥時，檢測C-kit突變位點顯得尤為重要，C-kit外顯子11號的缺失突變患者從中獲益最多，9號外顯子次之。根據晚期GIST患者的數據，C-kit外顯子9號突變患者通常接受更高劑量IM治療以獲取更好的DFS[24]。因此本研究結果需要更大的樣本量和對接受不同靶向治療劑量進行DFS分析來進一步佐證。

目前關于GIST復發的影響因素主要有原發部位、腫瘤最大徑、核分裂象數目及瘤體破裂等[25-26]。本研究結果顯示，腫瘤最大徑≥5 cm、核分裂像計數≥5個/50高倍視野、瘤體破裂、Ki-67增值指數≥5、中高危NIH分級、TNM分期Ⅱ、Ⅲ期是術后3年內復發的獨立危險因素(P<0.05)。CD117、CD34和DOG1是GIST特異性免疫指標[27]，本研究結果顯示陽性率由低到高依次為DOG10.05)，提示三者在GIST的表達是診斷GIST的敏感免疫組織化學指標，而不是預測復發指標。但也有人指出DOG1表達陰性GIST其預后往往較差[28]。無論開腹或腹腔鏡手術，所有患者均行R0切除。Zhen等[29]指出雖然腹腔鏡手術擁有較少術中出血量、較短術后康復時間，但在遠期預后差異很小。結果顯示腹腔鏡手術、開腹手術3年DFS相近，經單因素分析后得出術后3年DFS差異無統計學意義(P>0.05)，提示其不是預測復發指標。

綜上所述，R0切除胃腸道間質瘤患者C-kit基因突變特征與術后復發相關，其中9、11號外顯子突變是3年內復發的獨立危險因素；此外，腫瘤大小、核分裂像計數、腫瘤破裂、Ki-67增值指數、NIH分級及TNM分期均與術后3年內復發相關，這些指標可用于評估GIST患者的預后，為防治術后復發轉移制定個體化的治療方案。