牛蒡苷元對小鼠斷尾出血時間和血栓形成的影響*

潘彩燕，林曉堅，袁兆偉，張蓉，劉剛，謝娟

(1.貴州醫科大學 基礎醫學院 藥理學教研室，貴州 貴陽 550025；2.貴州省人民醫院 藥劑科，貴州 貴陽 550002；3.貴州醫科大學 藥學院，貴州 貴陽 550025)

牛蒡子(ArctiumlappaL)為菊科植物牛蒡的干燥成熟果實，是中醫常用的一味中藥[1]。牛蒡苷元(Arc-G)為木脂素類化合物，是牛蒡子中一類主要的活性物質。研究表明，Arc-G具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗心律失常、擴張血管及降低血糖等藥理作用[2-13]，還具有抗血小板活化因子的作用[14]，但關于Arc-G抗血栓作用的報道較少。因此，本實驗通過觀察Arc-G對正常小鼠血液成分和斷尾出血時間的影響，同時采用角叉菜膠誘發小鼠尾部血栓形成及凝血酶誘導體外血栓形成、觀察Arc-G對血栓形成的影響，探討Arc-G的抗血栓作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1動物 清潔級昆明種小鼠，雌雄各半，體質量為18～22 g，貴州醫科大學實驗動物中心提供[合格證號SCXK(黔)2018-0001]。

1.1.2藥品與試劑 Arc-G(麥克林試劑公司，批號18092808)，角叉菜膠(Sigma，批號CBG5890V)，凝血酶(Sigma公司, 批號LBV2136)，纖維蛋白原(Sigma公司, 批號SLBS4238)，司匹林腸溶片(大同市利群藥業有限責任公司，批號170605)。

1.1.3儀器 XS205型萬分之一電子天平(瑞士梅特勒-托利多科學儀器公司)，HK-UP-20分析型超純水機(合肥宏科科技有限公司)，全自動血液細胞分析儀(深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司)，RAC-1830全自動凝血分析儀(美國Rayto公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1小鼠斷尾出血時間[15]取32只昆明小鼠，隨機均分為空白對照組(生理鹽水)、阿司匹林組(100 mg/kg)、Arc-G低劑量組(12.5 mg/kg)和Arc-G高劑量組(50 mg/kg)，按給藥體積0.1 mL/10 g腹腔注射給藥，1次/d、連續7 d；末次給藥30 min時，在距離小鼠尾尖4 mm處剪斷，用濾紙吸取第1滴血，立即將小鼠尾巴垂直置于37 ℃ 生理鹽水中，記錄小鼠尾巴出血時間；血流停止后繼續觀察1 min，如果1 min內停止流血，則把血流停止時刻記為停止時間；若停止流血后1 min 內又復流，則繼續記錄，直到15 min還未停止，則出血時間記為15 min。

1.2.2血小板計數及血小板平均體積檢測 取32只昆明小鼠，分組給藥同1.2.1；末次給藥30 min時，下腔靜脈取血，肝素抗凝，全自動血液細胞分析儀對血小板數目和血小板平均體積(MPV)進行分析。

1.2.3凝血4項檢測 取32只昆明小鼠，分組給藥同1.2.2；末次給藥30 min時，下腔靜脈取血，3.8%枸櫞酸鈉抗凝，全自動凝血儀檢測凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶時間(TT)和纖維蛋白原(FIB)。

1.2.4小鼠尾部血栓模型的制備[16]取40只昆明小鼠，分組給藥同1.2.1。末次給藥30 min時，各組小鼠均腹腔注射角叉菜膠溶液(20 mg/kg)造模，正常飲食，24 h時用游標卡尺測量小鼠尾巴長度及黑尾長度，黑尾比率(%)=黑尾長度/鼠尾總長度×100%，以黑尾比率表示血栓形成率。

1.2.5斑塊回縮實驗[17]取10只25～30 g的健康昆明種小鼠，4%水合氯醛麻醉，下腔靜脈取血制備小鼠洗滌血小板，加入適量PPP重懸血小板，調整數目至2×1011個/L，室溫靜置1 h。取3 mL 洗滌血小板分裝到2 mL離心管中，500 μL/管，分為空白對照組(生理鹽水5 μL)、模型組(生理鹽水5 μL)、替羅非班組(替羅非班5 μL，終濃度為0.5 mg/L)、溶劑對照組(5%DMSO 5 μL)、Arc-G低劑量組(終濃度為3.125 μmol/L)及Arc-G高劑量組(終濃度為12.5 μmol/L)，各管分別加入CaCl25 μL(終濃度為1 mmol/L)、纖維蛋白原 10 μL(20 g/L)，輕柔混勻，除空白對照組外，各管分別加入凝血酶 5 μL(終濃度為20 000 U/L)，輕柔混勻，置于37 ℃水浴鍋內反應，并在 30 min 時觀察并拍照。用Image J軟件計算血塊回縮的面積、血塊回縮比率[血塊回縮比率(%)=(血塊面積/血塊回縮前面積)×100%]。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 斷尾出血時間

與空白對照組比較，阿司匹林組和Arc-G高劑量組可以顯著延長小鼠斷尾出血時間，差異有統計學意義(P<0.01)；Arc-G低劑量組也使小鼠的平均出血時間延長，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

注：與模型組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01。

2.2 血小板計數及血小板平均體積

連續腹腔注射Arc-G和阿司匹林7 d，與空白對照組比較，各組小鼠血小板數目、MPV比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 Arc-G對小鼠血小板計數和MPV的影響

2.3 PT、APTT、TT及FIB

與空白對照組比較，阿司匹林組顯著延長小鼠APTT，差異有統計學意義(P<0.05)，但對PT、TT、FIB的影響差異無統計學意義(P>0.05)，Arc-G對小鼠PT、APTT、TT及FIB差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 Arc-G對小鼠PT、APTT、TT及FIB的影響

2.4 靜脈血栓

與空白對照組相比較，Arc-G高劑量組可顯著減少由角叉菜膠引起的小鼠尾部血栓形成率(P<0.05)；低劑量也可減少小鼠黑尾比率，但差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

注：(1)與模型組比較，P<0.01。

2.5 體外血栓及血塊回縮實驗

與空白對照組比較，Arc-G低劑量、Arc-G高劑量或替羅非班均可明顯抑制血塊回縮，且高劑量Arc-G比低劑量Arc-G效果更佳(圖3)；與溶劑對照組比較，Arc-G低劑量、Arc-G高劑量可抑制血塊回縮(P<0.05，表3)。

圖3 Arc-G對斑塊回縮實驗的影響

表3 Arc-G對血塊回縮比率的影響

3 討論

血小板數目、血小板功能及凝血系統是影響止血功能的主要因素。本研究建立小鼠斷尾出血時間測定模型觀察Arc-G對小鼠止血功能的影響，間接評價Arc-G對血小板功能的作用。本實驗測定小鼠斷尾出血時間結果提示，Arc-G和阿司匹林均能顯著延長小鼠的尾巴出血時間；血液學分析結果提示，Arc-G對血小板數目、MPV的影響差異無統計學意義(P>0.05)；另外，血液凝血4項的測定結果提示，Arc-G對PT、APTT、FIB、TT的影響差異無統計學意義(P>0.05)；因此，Arc-G可能是通過影響血小板功能延長小鼠的止血時間。

角叉菜膠是從紅藻類海草中提取出來的硫酸多糖，能夠誘導機體釋放出白介素-1、腫瘤壞死因子等炎癥物質[18]，引起炎癥反應發生。這些炎癥介質可對正常內皮細胞造成損傷，導致炎細胞趨化、浸潤，使凝血系統被激活，從而影響血小板活化、凝血系統等相關蛋白質的表達，可誘導小鼠尾部形成血栓。角叉菜膠誘導的小鼠尾部血栓模型成功率高，操作簡單，易于重復，對小鼠損傷較小，且易于觀察和測量[19]，該模型已廣泛應用于評價功能性食品的抗血栓作用。血栓的形成過程復雜，與血小板的活性、血管內皮損傷等因素有關[20]。其中，血小板在血栓形成過程中起關鍵作用。血塊回縮是由于凝血酶激活血小板，催化纖維蛋白原轉化為纖維蛋白，形成穩定凝塊，反映了血小板在體外形成穩固血栓的過程。本實驗結果表明，Arc-G(50 mg/kg)可以顯著減少角叉菜膠誘導的小鼠尾部血栓的形成，能夠抑制凝血酶誘導的血塊回縮。

綜上所述，Arc-G延長小鼠尾巴出血時間可能與其能夠影響血小板功能有關，Arc-G可能是通過影響血小板功能發揮抑制血栓形成的作用。本研究只是初步考察了Arc-G抗血栓的作用，其發揮抗血栓作用的機制還有待進一步的研究。