卡瓦胡椒素B對人胰腺癌細胞增殖和侵襲能力的影響及機制*

李悅，崔冬冰，鄭迪杰，王秀紅*

(1.貴州醫科大學 護理學院，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫科大學 組織工程與干細胞實驗中心，貴州 貴陽 550004；3.貴州醫科大學附屬醫院 肝膽外科，貴州 貴陽 550004)

胰腺癌是目前公認的惡性程度極高的腫瘤之一，死亡率高、預后極差，患者生存率低于7%[1-2]。目前，臨床上治療胰腺癌主要采用手術切除及化、放療和其它局部對癥治療，治療效果十分有限[3]，所以亟需研發新的治療方法提高患者生存率。使用藥物抑制癌癥的發生和發展，被認為是治療腫瘤的有效方法之一[4]。天然產物是具有生物活性的天然來源化合物，近幾十年來開發的抗癌藥物有50%源自天然產物提取物發展而來，具有廣闊的發展前景[5-7]。有研究表明天然產物能夠通過調控自噬、誘導鐵死亡從而發揮抗腫瘤活性作用[8-9]?？ㄍ吆匪?flavokawain B, FKB)是從太平洋島嶼灌木叢中提取的一種天然產物，在胃癌、肺癌、前列腺癌等惡性腫瘤中具有明顯的抗癌作用[10-13]，但在胰腺癌中的研究鮮有報道。因此，本研究探討FKB對人胰腺癌細胞增殖、侵襲和凋亡的作用，為今后開發新的抗胰腺癌藥物提供一定的依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞來源 人胰腺癌細胞株PANC-1和SW1990購自武漢市同濟醫院肝膽胰外科實驗室。

1.1.2主要試劑 FKB(美國Abcam公司)，培養基(dulbecco′s modified eagle medium,DMEM)、0.25%胰蛋白酶及胎牛血清(美國Gibco公司)；6孔板、96孔板、Transwell小室(美國Corning公司)，細胞增殖毒性試劑盒(cell counting kit-8 ,CCK-8)試劑(日本Dojindo研究所)，Matrigel膠(美國BD公司)，波形蛋白(Vimentin)抗體、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)抗體、半胱天冬酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3,Caspase-3)抗體、Caspase-9抗體及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體(武漢Proteintech公司)，裂解緩沖液(radio immunoprecipitation ssay,RIPA)試劑、蛋白濃度測定試劑盒(bicinchoninic acid assay,BCA)及二甲基亞颯(dimethyl sulfoxide,DMSO；北京Solabio公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養及分組 人胰腺癌細胞株PANC-1和SW1990使用含有10%胎牛血清的DMEM培養液，置于37 ℃、CO2含量為5%的恒溫培養箱中孵育；當培養瓶中細胞生長至70%～80%后進行細胞傳代用以后續實驗；細胞分為對照組(0.1%DMSO)和5、10、20、40 μmol/L FKB組。

1.2.2CCK-8實驗 將處于對數期生長的PANC-1和SW1990細胞消化并計數，分別以3×103個/孔將2株胰腺癌細胞種于多個96孔板上，設5組復孔。待細胞貼壁后，分別加入DMSO和不同濃度的FKB(分組同1.2.1項下分組方式)，24、48及72 h后吸棄廢液，加PBS清洗，每孔加CCK-8試劑10 μL和無血清DMEM 100 μL，置于恒溫培養箱孵育3 h，檢測光密度(optical density，OD)值。

1.2.3平板克隆形成實驗 將處于對數期生長的PANC-1和SW1990細胞消化并計數，分別以1×103個/孔將2株胰腺癌細胞種于6孔板上；待細胞貼壁后進行加藥處理(分組同1.2.1項下分組方式)，添加DMEM培養液至5 mL；恒溫培養箱中培養10～14 d后棄培養基，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)清洗，加4%多聚甲醛1 mL固定30 min，吸棄后加1%結晶紫1 mL染色30 min，PBS清洗數遍，烘干，計數并拍照。

1.2.4Transwell實驗 Matrigel與無血清的DMEM按1∶7的比例稀釋，取50 μL加到Transwell上室待其凝固；將處于對數期生長的PANC-1和SW1990細胞消化進行饑餓處理24 h，分別取2×104個細胞種于小室內，加藥處理(分組同1.2.1項下方式)；補無血清培養基至200 μL，下室加含20%胎牛血清的DMEM培養液700 μL；恒溫培養箱孵育24 h，PBS清洗；加4%的多聚甲醛固定30 min，吸棄并加1%結晶紫染色30 min；PBS清洗，烘箱烘干，使用倒置光學顯微鏡拍照。

1.2.5Western blot檢測凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9以及上皮細胞-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)蛋白Vimentin、E-cadherin及N-鈣黏蛋白(N-cadherin) 將處于對數期生長的PANC-1和SW1990細胞消化后接種于6孔板中，進行藥物處理(分組同1.2.1項下方式)；置于恒溫培養箱培養24 h，吸棄廢液，PBS清洗數遍，每孔加0.25%胰蛋白酶500 μL消化，1 000 r/min離心5 min，棄上清；加RIPA 裂解液提取細胞總蛋白，使用BCA蛋白測定濃度試劑盒檢測各分組的蛋白濃度；根據蛋白上清液按比例1∶5加5×loading buff，置于水中100 ℃煮沸5 min；每孔取蛋白上樣品50 μg進行SDS-PAGE電泳，90 V電泳2 h，恒流300 mA轉膜2 h；5%脫脂牛奶封閉30 min，把條帶加入對應的Caspase-3、Caspase-9、Vimentin、E-cadherin、N-cadherin一抗中置于4 ℃搖床上過夜；緩沖鹽溶液(tris-HCl tween，TBST)清洗3次，10 min/次，將條帶置于辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠或兔IgG的二抗中孵育2 h，TBST清洗3次，10 min/次；使用增強型化學發光液(enhanced chemiluminescence，ECL)進行顯色。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 細胞增殖

FKB的化學結構式見圖1A。CCK8實驗檢測細胞的存活率結果顯示(圖1B和1C)，與DMSO組對比，FKB能抑制胰腺癌細胞的增殖，并且以濃度和時間依賴的方式對PANC-1和SW1990的抑制能力逐漸加強(P<0.05)；平板克隆實驗檢測結果顯示(圖1D～1F)，隨著FKB的濃度增加，對PANC-1和SW1990的抑制效果越發明顯(P<0.05)。上述結果表明，FKB能夠抑制胰腺癌細胞PANC-1和SW1990增殖能力。

注：A為FKB化學結構式，B、C為CCK-8實驗結果，D～F分別為細胞平板克隆實驗結果及定量結果；(1)與同時點DMSO組比較，P<0.05；(2)與同細胞DMSO組比較，P<0.05。

2.2 細胞侵襲能力

Transwell侵襲實驗結果顯示，隨著FKB的濃度逐漸增加，穿過小室的胰腺癌細胞數減少，表明隨著FKB的濃度增加，PANC-1和SW1990的侵襲能力逐漸下降，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

注：A～C分別為Transwell實驗胰腺癌細胞侵襲能力的形態學和定量結果；(1)與同細胞DMSO組比較，P<0.05。

2.3 Vimentin、N-Cadherin及E-Cadherin蛋白的表達

蛋白質印跡實驗表明，與DMSO組對比，當FKB的濃度逐漸上升后，Vimentin蛋白和N-Cadherin蛋白的表達逐漸下降，而E-Cadherin蛋白的表達水平呈上升趨勢(P<0.05)，表明FKB以濃度依賴方式抑制胰腺癌細胞的EMT蛋白表達(圖3)。

注：A為Western blot實驗結果，B、C為PANC-1和SW1190的EMT蛋白定量結果；(1)與同蛋白DMSO組比較，P<0.05。

2.4 Caspase-3和Caspase-9的表達

蛋白質印跡實驗提示，與DMSO組對比，隨著FKB的濃度逐漸上升后，Caspase-3和Caspase-9的蛋白表達水平逐漸下降(P<0.05)，表明FKB以濃度依賴方式促進胰腺癌細胞的凋亡蛋白表達(圖4)。

注：A為Western blot實驗結果，B、C為凋亡蛋白定量結果；(1)與同蛋白DMSO組比較，P<0.05。

3 討論

胰腺癌由于發病早期無明顯癥狀，轉移性強且進展迅速，通?；颊弑辉\斷時已為晚期，失去手術機會[14]。目前臨床上常用的抗腫瘤藥物為吉西他濱，但因副作用大導致治療效果不理想[15]。所以迫切需要研究新的抗腫瘤藥物。最近有研究表明，天然產物在預防和治療癌癥方面有一定的應用價值[16]。FKB是一種天然產物，源自于南太平洋島嶼學名為卡瓦的灌木[17]。有流行病學研究表明，在瓦努阿圖、斐濟及西薩摩亞等飲用卡瓦酒的國家中，居民的腫瘤發病率只占非卡瓦飲酒國家的1/3[18]。Li等[19]研究發現FKB通過靶向髓樣分化因子2減輕脂多糖誘導的急性肺損傷。Celentano 等[20]研究表明FKB能夠在體外對口腔鱗狀細胞癌細胞發揮選擇性的抗癌作用。因此將FKB作為本研究對象探尋其是否在體外能對胰腺癌細胞發揮抗腫瘤活性作用。

本研究CCK-8實驗和平板克隆結果顯示，與DMSO組相比，FKB以濃度-時間依賴的方式抑制胰腺癌細胞的增殖能力；Transwell侵襲實驗顯示，加藥組胰腺癌細胞中侵襲細胞數低于DMSO組，表明FKB能有效地減弱胰腺癌細胞的侵襲能力。細胞凋亡即程序性細胞死亡，其過程包括凋亡信號傳導階段、凋亡調控分子間的相互作用、蛋白水解酶的活化及進入連續反應過程[21]。大量研究表明，Caspase家族在凋亡過程中起著關鍵性作用[22-23]。當細胞接收凋亡誘導信號后會傳遞給啟動性型Caspase，使其轉化為二聚體并活化，開啟細胞內的凋亡程序[24]。本研究Western blot實驗結果顯示，加藥組胰腺癌細胞能夠促進凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9的表達增加，表明FKB能促進胰腺癌細胞的凋亡。

EMT是指上皮細胞通過特定的程序轉化為成具有高度遷移能力的間質細胞過程，在癌癥的侵襲和轉移過程中扮演著重要的角色[25]。在發生EMT的上皮細胞中，上皮標記物 E-cadherin的表達降低與間充質標志物N-cadherin、Vimentin表達升高是EMT的重要特征[26-27]。本研究結果表明，加藥組胰腺癌細胞中E-cadherin表達增加，N-cadherin和Vimentin的表達呈下降趨勢并呈濃度依賴性，表明FKB能夠抑制胰腺癌細胞的EMT進程，干預腫瘤細胞的EMT狀態。

綜上所述，FKB能夠促進胰腺癌細胞E-cadherin的表達，并抑制N-cadherin、Vimentin、Caspase-3和Caspase-9表達，從而促進凋亡并抑制胰腺癌細胞的增殖、侵襲及遷移。本研究證實了FKB在體外能夠抑制胰腺癌細胞，具有治療胰腺癌的新藥物的潛力，但若要進一步用于臨床還需要進行體內外研究和臨床研究。