黃草烏異戊烯基焦磷酸異構酶基因的克隆與功能研究

馬曉惠，曹小青，管麗娜，李國棟，王一博

·藥材與資源?

黃草烏異戊烯基焦磷酸異構酶基因的克隆與功能研究

馬曉惠*，曹小青，管麗娜，李國棟，王一博*

云南中醫藥大學中藥學院 云南省南藥可持續利用研究重點實驗室，云南 昆明 650500

對黃草烏的異戊烯基焦磷酸異構酶（isopentenyl diphosphate isomerase，IDI）基因進行克隆及功能研究，為黃草烏中二萜生物堿的生物合成途徑解析奠定基礎。基于黃草烏的轉錄組數據篩選注釋為的基因，設計特異性引物克隆其編碼區，利用相關軟件對其進行生物信息學分析，利用實時熒光定量PCR分析其在黃草烏不同器官中的表達情況，在大腸桿菌中表達其重組蛋白，利用功能顯色驗證其功能。從黃草烏中克隆得到1個基因（Genbank登錄號MZ814967）。生物信息學分析表明，的開放閱讀框（open reading frame，ORF）為897 bp，編碼298個氨基酸，分子式為C1516H2362N414O452S11，相對分子質量為33 970，理論等電點為5.94，具有異戊烯基焦磷酸異構酶TNTCCSHPL和WGEHELDY 2個保守序列。系統進化分析顯示，AvIDI與黃龍膽IDI的親緣關系最近。表達分析表明，基因在黃草烏根、莖、葉和花中均有表達，在莖中表達量最高。在大腸桿菌中成功表達了AvIDI重組蛋白，功能顯色實驗表明，編碼有功能的IDI蛋白，能促進大腸桿菌中番茄紅素的積累。克隆得到基因，并通過功能顯色實驗證明其編碼有功能的IDI蛋白，該研究為利用基因調控黃草烏中二萜生物堿生物合成奠定了基礎。

黃草烏；異戊烯基焦磷酸酶；基因克隆；生物信息學分析；功能顯色

黃草烏Kom.又被稱為藤草烏、昆明堵喇、昆明烏頭等，為毛茛科烏頭屬多年生草本植物[1]，其塊根作為藥材黃草烏入藥[2-3]，是云南白藥、云南紅藥等傷科藥的重要原料。黃草烏具有祛風散寒、解毒消腫、活血止痛等功效[4]，其主要毒性成分和有效成分是二萜生物堿類成分[5-6]，二萜生物堿的生源合成途徑受到廣泛關注。二萜生物堿的氨基化過程發生在二萜環狀碳骨架形成后，其因氨基化過程較晚而被稱為假生物堿（pseudoalkaloids）[7]。根據二萜生物堿的化學結構，科研工作者提出了其生源途徑：通過細胞質中的甲羥戊酸（mevalonate，MVA）途徑和質體中的2--甲基--赤藻糖醇-4-磷酸（2--methyl--erythritol- 4-phosphate，MEP）途徑合成異戊烯基焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate，IPP），其在異戊烯基焦磷酸異構酶（isopentenyl diphosphate isomerase，IDI/IPI）的催化作用下和其異構體二甲基丙烯基焦磷酸（dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP）進行互相轉化，IPP和DMAPP在牻牛兒基焦磷酸合酶（geranyl diphosphate synthase，GPS）、法呢基焦磷酸合酶（farnesyl diphosphate synthase，FPS）和牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶（geranylgeranyl pyrophosphate synthase，GGPPS）的作用下合成二萜前體牻牛兒牻牛兒焦磷酸（geranylgeranyl diphosphate，GGPP），GGPP在二萜合酶的作用下環化、重排形成二萜生物堿的基本環狀碳骨架結構考烷（kaurane）和阿替烷（atisane），二者在氨基轉移酶及細胞色素P450等酶的作用下發生氨基化、氧化等反應形成阿替生（atisines）型和維特欽型（veatchines）C20二萜生物堿，atisines和veatchines進一步通過重排、脫氨基等反應生成其他C20、C19和C18類二萜生物堿[7-9]。IDI通過調節IPP和DMAPP的穩態比例影響二萜生物堿的生物合成，黃草烏中基因的克隆及功能研究對黃草烏中二萜生物堿的生物合成途徑研究具有重要意義。

本研究基于黃草烏轉錄組數據，從黃草烏中克隆獲得1條基因，對其編碼蛋白的理化性質、保守結構域、系統進化關系等進行分析，用實時熒光定量PCR分析其在黃草烏不同器官的表達情況，并在大腸桿菌中異源表達研究其功能，為今后利用基因調控黃草烏中二萜生物堿的生物合成奠定基礎。

1 材料與試劑

1.1 材料

植物樣品于2019年10月采自云南省玉溪市澄江縣梁王山，經云南中醫藥大學李國棟副教授鑒定為黃草烏.Kom.。黃草烏沖洗干凈后經液氮速凍后留樣保存于云南省道地瀕危中藥材繁育與栽培工程技術研究中心實驗室?80 ℃冰箱。DH5α Chemically Competent Cell購自翌圣生物科技（上海）有限公司；BL21（DE3）Chemically Competent Cell和1-Blue Chemically Competent Cell均購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 試劑

pCold GST DNA購自寶生物工程有限公司；pTrc-和pAC-LYC由Francis X Cunningham Jr.Gantt（美國馬里蘭州學院馬里蘭大學）教授惠贈。

2 方法

2.1 總RNA提取及cDNA合成

采用Trizol法提取黃草烏根、莖、葉、花的總RNA，用超微量紫外可見分光光度計（DS-11，美國DENOVIXING）和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量，用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（perfect real time）（TaKaRa公司）將RNA反轉錄為cDNA，cDNA保存于?20 ℃冰箱。

2.2 基因克隆

從黃草烏轉錄組中共獲得1條注釋為基因的序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計全長無縫克隆特異性引物pCold--F（5’-GGT- ACCCTCGAGGGATCCATGTCGACGATCGGATT-GAAC-3’）和pCold--R（5’-TCTAGACTG- CAGGTCGACTCAAGTCAATTTGTGGATTG-3’）。以黃草烏根cDNA為模板擴增其全長，PCR反應體系（50 μL）：PrimeSTAR HS（Premix）25 μL、正向和反向引物（10 μmol/L）各1 μL、cDNA 1 μL、雙蒸水（ddH2O）22 μL。反應程序：94 ℃、5 min； 98 ℃、10 s，55 ℃、15 s，72 ℃、60 s，34個循環；72 ℃、10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后純化，連入原核表達載體pCold GST DNA，轉化DH5感受態細胞，于含氨芐青霉素（ampicillin，AMP）（100 mg/L）的LB平板上，37 ℃培養12～16 h。從平板上挑取單克隆進行菌落PCR驗證，陽性結果送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，將測序正確的重組質粒命名為pCold GST DNA-。

2.3 生物信息學分析

利用NCBI（National Center for Biotechnology Information）在線分析基因的開放閱讀框（open reading frame，ORF）和同源性；利用ExPASy-ProtParam tool （https://web.expasy.org/ protparam/）在線分析AvIDI蛋白的理化性質；利用TMHMM 2.0（http://www. cbs.dtu.dk/services/ TMHMM/）在線分析AvIDI蛋白的跨膜區；利用SignalP 5.0（https://services.healthtech.dtu.dk/ service.php?SignalP-5.0）分析信號肽；用WoLF PSORT （https://wolfpsort.hgc.jp/）預測AvIDI的亞細胞定位；使用InterPro（http://www.ebi.ac. uk/interpro /search/sequence-search）分析AvIDI的結構域；使用SOMPA （https://npsa prabi. ibcp.fr/cgi- bin/npsa_automat.pl? page=/NPSA/npsa_sopma. html）在線預測蛋白的二級結構；使用SWISS- MODEL（http://swissmodel. expasy.org/）預測蛋白的三級結構；利用BioEdit軟件進行氨基酸序列多重比對；利用NCBI的蛋白質序列數據庫搜索同源序列，用MEGA6.0構建系統進化樹，bootstrap為1000。

2.4 表達分析

根據序列設計實時熒光定量PCR引物-qRT-F（5’-GCTTCTGGATGAACTGGGTA- TT-3’）和-qRT-R（5’-ATTTGACGTCGCGGA- CTATG-3’），以作為內參基因[10]，實時熒光定量PCR反應在Roche LightCycler?96實時熒光PCR儀上進行。qRT-PCR反應體系（20 μL）：TB Green Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（2×）10 μL、cDNA 2 μL、正向反向引物（10 μmol/L）各1 μL，雙蒸水（ddH2O）6 μL。反應程序：95 ℃、30 s；95 ℃、5 s，55 ℃、30 s，72 ℃、10 s，40個循環；95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，95 ℃、1 s。黃草烏根、莖、葉和花各設3個生物學重復，每個樣品設3個技術重復。用LightCycler?96 SW以及SPSS軟件分析結果。的相對表達量用2?ΔΔCt法計算。

2.5 AvIDI重組蛋白表達

將重組質粒pCold GST DNA-轉化至大腸桿菌BL21（DE3）Chemically Competent Cell，挑取單克隆于含AMP（100 mg/L）的LB液體培養基中，37 ℃ 250 r/min培養至吸光度（600）為0.6～1.0，加入異丙基-β--硫代半乳糖苷（IPTG）至終濃度1 mmol/L，于15 ℃誘導培養菌液15 h。離心收集菌體，加入PBS緩沖液復溶，用超聲波細胞破碎儀以5 s/8 s程序超聲破碎菌體至液體澄清，4 ℃離心收集上清和沉淀，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳分析蛋白表達情況。以轉化pCold GST DNA的BL21（DE3）進行隨行實驗作為對照。

2.6 功能顯色

限制性核酸內切酶I和H I酶切表達載體pTrc-，切膠回收獲得鏈狀pTrc載體；以重組質粒pCold GST DNA-1為模板，用pTrc-AvIDI-F （5’-GGGGTACCATGTCGACGATC- GGATTGAA-3’）和pTrc-AvIDI-R （5’-CGGGAT- CCTCAAGTCAATTTGTGGATTGTT-3’）為引物進行PCR擴增，PCR產物純化后用I和H I酶切，酶切產物純化后用T4連接酶與鏈狀pTrc載體進行連接，連接產物轉化Trans1-Blue Chemically Competent Cell，于含AMP（100 mg/L）的LB平板37 ℃培養12～16 h，菌落PCR驗證并送測序，將測序結果正確的重組質粒命名為pTrc-。將質粒pTrc、pTrc-和pTrc-分別與pAC-LYC共轉化1-Blue感受態細胞，于含AMP（100 mg/L）和氯霉素（chloramphenicol，Cm，20 mg/L）的LB平板37 ℃培養12～16 h。同時將pAC-LYC轉化1-Blue感受態細胞，于含Cm（20 mg/L）的LB平板上培養。將菌落PCR驗證正確的單克隆點于含AMP（100 mg/L）和Cm（20 mg/L）的LB平板上，28 ℃培養3～4 d，觀察菌斑的顏色變化。

3 結果與分析

3.1 AvIDI的基因克隆

以黃草烏根的cDNA為模板擴增基因，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示，在1000 bp附近有明亮的條帶（圖1），與黃草烏轉錄組中長度一致，將PCR產物連入表達載體pCold GST DNA，獲得重組質粒pCold GST DNA-，測序結果表明，的ORF為897 bp，編碼298個氨基酸。

3.2 生物信息學分析

3.2.1 理化性質分析 AvIDI蛋白的相對分子質量為33 970，理論等電點（pI）為5.94。跨膜結構域分析結果表明，AvIDI蛋白無跨膜結構，為非膜蛋白。信號肽分析表明，AvIDI蛋白無信號肽，為非分泌蛋白。亞細胞定位預測結果表明，AvIDI蛋白定位于葉綠體上。結構域分析表明（圖2），AvIDI含有NUDIX水解酶域（NUDIX hydrolase_dom，116～255 aa）和IPP異構酶的結構域（IsopentenylPP_isomerase_typ1，86～268 aa）。蛋白二級結構預測結果顯示，AvIDI蛋白二級結構中α-螺旋占54.03%，延伸鏈占12.08%，β-轉角占5.37%，無規則卷曲占28.52%，AvIDI蛋白的主要結構元件是α-螺旋和無規則卷曲。以人類IDI蛋白（2i6k.1.A）為模板（序列相似度為53.30%），用SWISS-MODEL模擬構建AvIDI蛋白質的三級結構，結果見圖3。3.2.2 多重序列比對及系統發育樹分析 NCBI在線blast分析表明，AvIDI蛋白與黃龍膽IDI蛋白相似度最高，相似度為91.06%。用BioEdit將AvIDI的氨基酸序列與其他物種已報道有功能的IDI氨基酸序列進行多重序列比對，AvIDI具有IDI蛋白高度保守的TNTCCSHPL和WGEHELDY序列（圖4）。在NCBI中下載已報道的IDI蛋白序列，用MEGA6.0構建系統發育樹，結果表明，AvIDI與植物IDI聚為一支，與黃龍膽的親緣關系最近（圖5）。

圖1 AvIDI的PCR擴增產物

圖2 AvIDI功能結構域預測

圖3 AvIDI蛋白三級結構預測

AtIDI-Arabidopsis thaliana IDI (NP197148.3) GlIDI-Gentiana lutea IDI (BAE92732.1) HpIDI-Hypericum perforatum IDI (JAW07394.1) OsIDI-Opuntia streptacantha IDI (MBM5471501.1) RmIDI-Rhizophora mucronate IDI (MBW95860.1) TwIDI-Tripterygium wilfordii IDI (ALB26774.1) CaIDI-Camptotheca acuminata IDI (ABI13583.1) SmIDI-Salvia miltiorrhiza IDI (ABV08818.1) GbIDI-Gossypium barbadense IDI (ABI94388.1) PvfIDI1-Panax vietnamensis var. fuscidiscus (MZ736417.1) PvfIDI2-Panax vietnamensis var. fuscidiscus (MZ736418.1)

3.3 AvIDI在黃草烏不同器官的表達分析

以為內參基因分析在黃草烏根、莖、葉和花中的表達，結果如圖6所示，在黃草烏各個器官中均有表達，在莖中表達量最高，在根中表達量其次，在葉和花中表達量較低。

3.4 AvIDI重組蛋白表達

SDS-PAGE電泳結果（圖7）顯示，含重組質粒pCold GST DNA-的菌株在約60 000處有明顯蛋白條帶（融合蛋白理論相對分子質量為AvIDI理論相對分子質量33 970與26 000的GST標簽之和），與預期AvIDI融合蛋白大小一致，且上清和沉淀中均出現了明顯的條帶，說明在大腸桿菌BL21（DE3）中成功表達了。

3.5 功能顯色驗證AvIDI功能

番茄紅素是一種天然紅色開鏈烴類胡蘿卜素，主要存在一些紅色果蔬中，大腸桿菌本身不能自身產生番茄紅素，由于pAC-LYC中含有3個參與番茄紅素合成的基因，即香葉基香葉基焦磷酸合成酶（）、八氫番茄紅素合成酶（）和八氫番茄紅素脫飽和酶（），轉化pAC-LYC的大腸桿菌可產生番茄紅素，菌斑顏色可以反映大腸桿菌中番茄紅素的產量，菌斑的顏色越深，番茄紅素的量越多[11-12]。將pTrc、pTrc-和pTrc-分別與質粒pAC-LYC共轉化大腸桿菌1-blue。從圖8可知，僅轉化pAC-LYC的菌株（P2）在同時含有AMP和Cm的LB培養基上無法生長，含有pTrc和pAC-LYC的菌株（P1）在同時含有AMP和Cm的LB培養基上能正常生長并呈現淺粉色，說明其能產生少量番茄紅素，含有pAC-LYC及pTrc-和pTrc-的菌株（分別為At和Av）均能正常生長，且其顏色較P1深，說明At和Av中產生的番茄紅素較P1多，由此表明，和編碼有功能的IDI蛋白，均可以促進番茄紅素的生物合成。

圖5 IDI蛋白系統發育樹

不同小寫字母代表差異顯著（P＜0.05）

Fig 6 Expression of AvIDI in different organs of

M-Marker TP-總蛋白 S-上清液 P-沉淀

圖8 AvIDI在大腸桿菌中的功能顯色

4 討論

烏頭屬含有多種藥用植物，二萜生物堿是黃草烏等多種烏頭屬植物的鎮痛活性成分，科研工作者構建了烏頭屬異葉烏頭Pritz.[13-14]、烏頭Debeaux[15-18]和黃草烏[19]等多種植物的轉錄組，烏頭屬植物的轉錄組為二萜生物堿生物合成途徑研究提供了大量基礎數據，為二萜生物堿生物合成途徑中基因的功能鑒定奠定了基礎。然而，關于二萜生物堿生物合成途徑中相關基因的克隆及功能研究較少，Mao等[16]從烏頭中克隆并鑒定了12個二萜合酶，包括7個AcCPS和5個AcKSL，7個AcCPSs均催化GGPP生成ent-copalyl diphosphate（-CPP），而AcKSL催化ent-CPP分別生成-kaurene、-atiserene和-13-epi- sandaraco- pimaradie 3種產物，該研究推動了二萜生物堿生物合成途徑的解析進程。IPP和DMAPP是萜類化合物的重要前體，二者在IDI作用下進行相互轉化，IDI通過調控IPP和DMAPP的比例及含量影響萜類及其衍生物的生物合成，因此基因的克隆及功能研究對萜類化合物的生物合成途徑研究及其應用具有重要意義。目前，茶樹、煙草、擬南芥、雷公藤、丹參、海島棉和越南參等多種植物的基因已克隆獲得，并通過原核表達或RNAi等方法對其進行功能研究[20-26]。其中，茶樹、擬南芥和越南參等植物中報道了2個基因[24-26]，而雷公藤和丹參等植物中僅報道了1個基因[20-21]。不同植物中的基因數量不完全一致，可能由于不同植物中本身存在的基因數量不一致，也可能與轉錄組測序深度有關，目前很多基因的挖掘都依賴于轉錄組，而轉錄組測序的深度與基因的完整性密切相關，為了全面深入挖掘相關基因，可充分結合基因組和轉錄組進行相關工作。

黃草烏是云南特色藥用植物資源，二萜生物堿是其活性成分，為了研究黃草烏中二萜生物堿的生物合成途徑，本研究從黃草烏中克隆得到1條基因，對其進行了相關生物信息學分析，在大腸桿菌中成功表達AvIDI重組蛋白，并通過顯色反應證明其編碼有功能的IDI蛋白，能促進大腸桿菌中番茄紅素的積累。黃草烏中IDI基因的克隆及功能研究為利用IDI基因調控二萜生物堿的生物合成奠定了基礎。

志謝：美國馬里蘭州學院馬里蘭大學Francis X Cunningham Jr. (Gantt) 教授惠贈實驗所用載體，首都醫科大學童宇茹博士對實驗的指導。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 李雪佩, 何俊,賀水蓮, 等. 黃草烏植物的研究進展 [J]. 西部林業科學, 2017, 46(6): 1-7.

[2] 重慶市中藥飲片炮制規范及標準（2006年版）[S]. 2006: 152.

[3] 云南省中藥材標準-第一冊: 2005年版 [S]. 2005: 26.

[4] 王麗蘋, 陳強威, 沈志濱, 等. 黃草烏及其炮制品的毒性和鎮痛作用研究 [J]. 中藥材, 2018, 41(8): 1864-1868.

[5] 溫玉瑩, 王麗蘋, 沈志濱, 等. 黃草烏及其炮制品對心臟毒性的作用和機制研究 [J]. 中藥材, 2019, 42(6): 1277-1282.

[6] 黎雖宇, 劉小赟, 唐春萍, 等. 黃草烏炮制前后生物堿含量及心臟毒性差異研究[J]. 中草藥, 2018, 49(23): 5588-5593.

[7] Devkota K P, Sewald N. Terpenoid alkaloids derived by amination reaction [J]., 2013: 923-951.

[8] Cherney E C, Baran P S. Terpenoid-alkaloids: Their biosynthetic twist of fate and total synthesis [J]., 2011, 51(3/4): 391-405.

[9] 肖培根, 王鋒鵬, 高峰, 等. 中國烏頭屬植物藥用親緣學研究 [J]. 植物分類學報, 2006, 44(1): 1-46.

[10] 曾禮芳, 李國棟, 王寶婕, 等. 黃草烏實時熒光定量PCR內參基因的篩選 [J]. 中國中藥雜志, 2021, 46(12): 3116-3122.

[11] Alonso-Gutierrez J, Chan R, Batth T S,. Metabolic engineering offor limonene and perillyl alcohol production [J]., 2013, 19: 33-41.

[12] Cunningham F X Jr, Sun Z, Chamovitz D,. Molecular structure and enzymatic function of lycopene cyclase from the cyanobacteriumsp strain PCC7942 [J]., 1994, 6(8): 1107-1121.

[13] Malhotra N, Kumar V, Sood H,. Multiple genes of mevalonate and non-mevalonate pathways contribute to high aconites content in an endangered medicinal herb,Wall [J]., 2014, 108: 26-34.

[14] Pal T, Malhotra N, Chanumolu S K,. Next-generation sequencing (NGS) transcriptomes reveal association of multiple genes and pathways contributing to secondary metabolites accumulation in tuberous roots ofWall [J]., 2015, 242(1): 239-258.

[15] Rai M, Rai A, Kawano N,. De novo RNA sequencing and expression analysis ofto analyze key genes involved in the biosynthesis of diterpene alkaloids [J]., 2017, 22(12): 2155.

[16] Mao L Y, Jin B L, Chen L L,. Functional identification of the terpene synthase family involved in diterpenoid alkaloids biosynthesis in[J]., 2021, 11(10): 3310-3321.

[17] Zhao D K, Shen Y, Shi Y N,. Probing the transcriptome ofreveals the candidate genes associated with the biosynthesis of the toxic aconitine-type C19-diterpenoid alkaloids [J]., 2018, 152: 113-124.

[18] 張大燕, 文歡, 王偉, 等. 烏頭萜類生物合成代謝的轉錄組學分析 [J]. 中國實驗方劑學雜志, 2017, 23(16): 45-50.

[19] Li Y G, Mou F J, Li K Z. De novo RNA sequencing and analysis reveal the putative genes involved in diterpenoid biosynthesis inroots [J]., 2021, 11(2): 96.

[20] Tong Y R, Zhang M, Su P,. Cloning and functional characterization of an isopentenyl diphosphate isomerase gene from[J]., 2016, 63(6): 863-869.

[21] Zhang X N, Guan H Y, Dai Z B,. Functional analysis of the isopentenyl diphosphate isomerase ofvia color complementation and RNA interference [J]., 2015, 20(11): 20206-20218.

[22] Wang Y C, Qiu C X, Zhang F,. Molecular cloning, expression profiling and functional analyses of a cDNA encoding isopentenyl diphosphate isomerase from[J]., 2009, 29(2): 111-119.

[23] Yan N, Zhang H B, Zhang Z F,. Organ- and growing stage-specific expression of solanesol biosynthesis genes inreveals their association with solanesol content [J]., 2016, 21(11): 1536.

[24] Phillips M A, D'Auria J C, Gershenzon J,. Thetype I isopentenyl diphosphate isomerases are targeted to multiple subcellular compartments and have overlapping functions in isoprenoid biosynthesis [J]., 2008, 20(3): 677-696.

[25] 陳丹, 王鵬杰, 陳笛, 等. 茶樹CsIDI1和CsIDI2基因的克隆及其表達分析 [J]. 西北植物學報, 2018, 38(5): 800-807.

[26] 王一博, 管麗娜, 曹小青, 等. 越南參變種異戊烯基焦磷酸異構酶基因的克隆與功能研究 [J]. 藥學學報, 2021, 56(12): 3362-3369.

Cloning and functional characterization of isopentenyl diphosphate isomerase gene from

MA Xiao-hui, CAO Xiao-qing, GUAN Li-na, LI Guo-dong, WANG Yi-bo

Yunnan Key Laboratory of Sustainable Utilization of Southern Medicine, College of Chinese Materia Medica, Yunnan University of Chinese Medicine, Kunming 650500, China

To clone and functionally study the isopentenyl diphosphate isomerase (IDI) gene of, so as to lay a foundation for the analysis of the biosynthetic pathway of diterpene alkaloids in.The genes annotated aswere selected from the transcriptome data of. Specific primers were designed to clone the coding regions. Bioinformatics analysis was performed with relevant software. Real-time quantitative PCR was used to analyze their expression level in different organs of. The recombinant protein was expressed in, and its function was verified by functional coloration experiment.Angene (, Genbank accession No. MZ814967) was cloned from. Bioinformatics analysis showed that the open reading frame ofwere 897 bp encoding 298 amino acids. The molecular formula of AvIDI was C1516H2362N414O452S11. The molecular weight of AvIDI was 33 970 with a theoretical pI of 5.94. AvIDI contained two conserved sequences of TNTCCSHPL and WGEHELDY. Phylogenetic analysis showed that AvIDI was closely related toIDI. Expression analysis showed thatexpressed in root, stem, leaf and flower of, with highly expression in the stem. The recombinant protein of AvIDI was successfully expressed in. The functional coloration experiment inshowed thatencoded a functional IDI protein and promoted the accumulation of lycopene.Thewas cloned and proven to encode a functional IDI protein. This study laid a foundation for the regulation of diterpenoid alkaloids biosynthesis inwithgene.

Kom.; isopentenyl diphosphate isomerase; gene cloning; bioinformatics analysis; functional coloration

R282.12

A

0253 - 2670(2022)16 - 5142 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.16.023

2022-02-09

中央本級重大增減支項目（2060302）；云南省科技人才和平臺計劃（202105AG070012）

馬曉惠，講師，從事分子生藥學研究。E-mail: maxiaohui1988@126.com

王一博，碩士，從事分子生藥學研究。E-mail: 2498927287@qq.com

[責任編輯 時圣明]