Box-Behnken響應面優化蛇葡萄素納米結構脂質載體處方工藝及體外評價

麥琬婷，鐘華帥，蘇曉丹，陸建媚，覃裕翠，黃秋潔，葉 勇, 3*

Box-Behnken響應面優化蛇葡萄素納米結構脂質載體處方工藝及體外評價

麥琬婷1, 4，鐘華帥1#，蘇曉丹1，陸建媚1，覃裕翠1，黃秋潔2*，葉 勇1, 3*

1. 廣西醫科大學藥學院，廣西 南寧 530021 2. 廣西中醫藥大學藥學院，廣西 南寧 530001 3. 廣西生物活性分子研究與評價重點實驗室，廣西 南寧 530021 4. 貴港市人民醫院，廣西 貴港 537100

目的 優化蛇葡萄素納米結構脂質載體（ampelopsin loaded nanostructured lipid carriers，AMP-NLC）處方并對其進行質量表征，研究其對SMMC-7721細胞抑制作用和攝取情況。采用有機溶劑蒸發法制備AMP-NLC，在單因素實驗基礎上結合Box-Behnken響應面優化AMP-NLC處方并對其進行質量表征。用MTT法測定SMMC-7721細胞的半數抑制濃度（inhibitory concentration of 50%，IC50），并用羅丹明B染料觀察其攝取情況。最優處方為山崳酸甘油酯與中鏈三酰甘油的比例為1∶11.5、藥脂比為1∶10.5、蛋黃卵磷脂用量為21 mg和P188的用量為2%，所制AMP-NLC的平均包封率為（81.71±1.76）%、平均載藥量為（3.86±0.22）%、平均粒徑為（156.50±7.11）nm和平均ζ電位為（?11.00±0.95）mV，體外釋藥過程符合一級釋放模型＝47.93(1－e?0.625 2 t)，蛇葡萄素和AMP-NLC對SMMC-7721細胞的IC50分別為44.51、41.51 μg/mL，且相對蛇葡萄素原料藥，SMMC-7721細胞對AMP-NLC有較好攝取。Box-Behnken響應面法所建立的模型可用于AMP-NLC處方優化，AMP-NLC能有效提高蛇葡萄素在SMMC-7721細胞的相對攝取。

蛇葡萄素；Box-Behnken響應面優化；納米結構脂質載體；質量評價；細胞攝取；體外靶向性

蛇葡萄素（ampelopsin），又名二氫楊梅素，是一種重要的黃酮類化合物，廣泛存在于葡萄科、楊梅科、杜鵑科、藤黃科、大戟科及柳科等植物中，其中以葡萄科蛇葡萄屬植物顯齒蛇葡萄(Hand. -Mazz.) W. T. Wang中含量最為豐富，高達37.4%～38.5%[1-2]。在廣西顯齒蛇葡萄又稱甜茶藤，壯藥名為“茶完”，目前收載在《廣西壯族自治區壯藥質量標準》（第一卷）[3]。作為一種壯族民間保肝的特效藥材，甜茶藤常用于治療黃疸性肝炎和感冒風熱等癥。研究表明，蛇葡萄素具有顯著的抗肝癌[4]、抗氧化[5]、抗菌[6]、抗炎[7-8]和骨重塑[9]等作用。但是，由于其水溶性低、黏膜滲透性差和體內穩定性不佳等原因，導致其體內的生物利用度很低[10-11]，從而限制了其臨床應用。因此，需借助現代制劑技術改善蛇葡萄素體內吸收及穩定性差的問題。文獻報道的二氫楊梅素長循環納米脂質體包封率只有約54%[12]，且穩定性和緩釋性不夠理想。郜娜等[13]制備了二氫楊梅素磷脂復合物納米結構脂質載體，需先制備磷脂復合物，工藝較為繁瑣，且制備過程中使用的四氫呋喃、石油醚等具有一定毒性的溶劑，此外所得包封率不高（低于80%）。黃娟等[14]制備了二氫楊梅素固體自微乳，但處方中主要含有無機材料二氧化硅，其體內安全性問題尚需深入研究[15]，因此，其應用具有一定局限性。

納米結構脂質載體（nanostructured lipid carrier，NLC）是新一代脂質納米粒，通過加入液態脂質，擾亂固體脂質規則的晶格結構，增加晶體的混亂度，為藥物的包載創造了更大空間，可大幅提高藥物的包封率及載藥量[16-17]。此外，NLC還能進一步延緩藥物釋放、增加藥物透膜性及提高藥物穩定性，是一種理想的納米藥物靶向載體[18]。因此，本課題擬采用Box-Behnken響應面法對蛇葡萄素納米結構脂質載體（ampelopsin loaded nanostructured lipid carriers，AMP-NLC）的處方進行優化，并研究其質量表征及體外細胞的攝取情況，以期為后續體內抗肝癌藥效學、藥動學等研究奠定基礎，也為壯藥甜茶藤中蛇葡萄素的新制劑研發提供科學依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；HH-2型數顯電子恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；SU8100型掃描電子顯微鏡（SEM）、H-7650型透射電子顯微鏡（TEM），日本Htachi公司；SmartLab-9kW型轉靶X-射線粉末衍射儀（XRD），日本理學株式會社；Zetasizer Nano ZS型激光粒度儀，英國馬爾文公司；XS205DU型分析天平，梅特勒托利多集團；DSC1型差式掃描量熱儀（DSC），瑞士梅特勒托利多公司；Eppendorf5810R型冷凍離心機，賽默飛世爾科技公司；Nicolet is 20型傅里葉紅外光譜儀（FT-IR），賽默飛世爾科技公司；Aynergy H1型酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；德國徠卡DMi8型倒置熒光顯微鏡，德國徠卡公司。

1.2 試藥與試劑

蛇葡萄素對照品，批號Q-006-181218，質量分數98.0%，成都瑞芬思生物科技有限公司；色譜純乙腈，賽默飛世爾科技公司，批號F21LB8201；伯洛沙姆188（P188），德國BASF有限公司，批號GNC33221B；山崳酸甘油酯，江西阿爾法高科藥業有限公司，批號20201001；中鏈三酰甘油，Croda Singapore Pte Ltd.，批號627884；Lipoid E80SN，Lipoid GmbH，批號512100-2190153；DMEM培養基，Gibco公司，批號8121372；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS），美國Gemini公司，批號A61H74L；青鏈霉素混合液（批號20210818）、磷酸鹽緩沖液（PBS，批號20211124）、四甲基偶氮唑鹽［3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT，批號715F0527］、Hoechst33342（批號1118IO35），索萊寶生物科技有限公司；DMSO，批號20200401，天津市大茂化學試劑廠；羅丹明B（rhodamine B，RhB），批號C10472170，默克試劑公司。

1.3 細胞

SMMC-7721細胞均購自上海細胞生物學研究所細胞庫。

2 方法與結果

2.1 AMP-NLC的制備

精密稱取處方量的山崳酸甘油酯、中鏈三酰甘油、卵磷脂、蛇葡萄素和無水乙醇，置于20 mL燒杯中，作為油相；另取處方量的2% P188于20 mL燒杯中，作為水相。待油相完全溶解后，將油相加入到同溫度的水相中，用恒溫磁力攪拌器在65 ℃條件下攪拌60 min，使其充分乳化，過0.22 μm微孔濾膜，即得AMP-NLC，4 ℃保存。

同法制備不含蛇葡萄素的空白納米結構脂質載體（blank loaded nanostructured lipid carriers，B-NLC）和含羅丹明B的納米結構脂質載體（rhodamine loaded nanostructured lipid carriers，RhB-NLC）。

2.2 蛇葡萄素的測定

2.2.1 溶液的配制 精密稱取蛇葡萄素對照品5 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解并定容至刻度，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，即得200 μg/mL對照品儲備液。

2.2.2 色譜條件 色譜柱為日本GL Sciences C18分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.2%磷酸三乙胺溶液（25∶75）；體積流量1 mL/min；檢測波長291 nm；柱溫30 ℃，進樣量20 μL，經考察輔料對檢測無影響，結果見圖1。

2.2.3 精密度考察

（1）日內精密度：取10、50、100 μg/mL蛇葡萄素對照品溶液，按“2.2.2”項色譜條件測定，1 d連續進樣6次，記錄峰面積，計算RSD。結果表明，低、中、高質量濃度蛇葡萄素對照品溶液的RSD分別為1.89%、1.55%、1.08%，表明日內精密度較好。

圖1 蛇葡萄素對照品(A)、B-NLC樣品 (B)和AMP-NLC樣品 (C)的HPLC圖

（2）日間精密度：取10、50、100 μg/mL蛇葡萄素對照品溶液，按“2.2.2”項色譜條件測定，連續進樣6 d，記錄峰面積，計算RSD。結果表明，低、中、高質量濃度蛇葡萄素對照品溶液的RSD分別為3.13%、3.59%、4.33%，表明日間精密度較好。

2.2.4 線性關系考察 取“2.2.1”項下200 μg/mL蛇葡萄素對照品溶液，分別配制成5、10、25、50、100、200 μg/mL的蛇葡萄素對照品溶液，按“2.2.2”項下色譜條件測定，記錄峰面積，以峰面積為縱坐標（），以質量濃度為橫坐標（），繪制標準曲線，進行線性回歸，得蛇葡萄素線性回歸方程＝48.959－27.274，＝0.999 8，表明蛇葡萄素在5～200 μg/mL線性關系良好。

2.2.5 準確度考察

（1）方法回收率：配制25、65、85 μg/mL的蛇葡萄素甲醇溶液，按“2.2.2”項下色譜條件測定，記錄峰面積，將峰面積代入標準曲線方程換算得實際測定質量濃度，計算方法回收率。實驗結果表明，方法回收率分別為108.92%、85.76%、108.86%，RSD為2.48%、2.48%、0.99%，均符合要求。

（2）加樣回收率：按處方量的80%、100%、120%稱取蛇葡萄素原料藥適量，分別加入處方量的各個輔料，加入甲醇超聲溶解并定容，搖勻，配成質量濃度分別為10、50、100 μg/mL，平行3次，共9份，按“2.2.2”項下色譜條件測定，記錄峰面積，計算加樣回收率。實驗結果表明，加樣回收率分別為99.01%、103.11%、105.63%，RSD為3.32%、1.19%、1.74%，均符合要求。

2.2.6 重復性試驗 按“2.2.4”項方法平行制備6份蛇葡萄素對照品溶液，按“2.2.2”項下色譜條件測定，記錄峰面積，計算蛇葡萄素質量分數的RSD。結果表明，RSD為2.77%，表明重復性好。

2.2.7 穩定性試驗 將蛇葡萄素對照品溶液稀釋至8、50、100 μg/mL，分別于0、2、4、6、8、10、12 h，按“2.2.2”項下色譜條件測定，記錄峰面積，計算RSD，觀察12 h內穩定情況，結果表明，RSD分別為4.43%、1.08%、1.19%，表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.3 AMP-NLC包封率和載藥量的測定

采用超濾離心法測定包封率和載藥量，精密量取一定量的AMP-NLC加入6倍量的40%乙醇，置10 000截留相對分子質量的離心超濾管內管中，于10 000 r/min離心（離心半徑7.5 cm）30 min，過0.22 μm微孔濾膜，按“2.2.2”項下色譜條件測定，記錄峰面積，計算游離蛇葡萄素的含量。另取等量的AMP-NLC置于5 mL量瓶內，用甲醇定容至刻度，過0.22 μm微孔濾膜，按“2.2.2”項下色譜條件測定，記錄峰面積，計算總蛇葡萄素的含量，按照公式（1）、（2）計算包封率和載藥量。

包封率＝(2－1)/2（1）

載藥量＝(2－1)/(2＋3) （2）

1為游離藥物的量，2為系統中藥物的總量，3為系統中輔料的量

2.4 單因素實驗

2.4.1 固態脂質種類的考察 改變固態脂質種類，其他條件不變，固態脂質種類分別為單硬脂酸甘油酯和山崳酸甘油酯，按“2.1”項下方法制備AMP-NLC，以包封率和載藥量為指標進行考察。結果表明，使用單硬脂酸甘油酯和山崳酸甘油酯的包封率分別為59.77%和84.34%，載藥量分別為2.36%和2.38%，即選擇崳酸甘油酯做固態脂質。

2.4.2 液態脂質種類的考察 改變液態脂質種類，其他條件不變，液態脂質種類分別為中鏈三酰甘油、油酸和大豆油，按“2.1”項下方法制備AMP-NLC，以包封率和載藥量為指標進行考察。結果表明，使用中鏈三酰甘油，油酸和大豆油的包封率分別為76.90%、50.22%、56.06%，載藥量分別為2.05%、0.19%、1.33%，即選擇中鏈三酰甘油做液態脂質。

2.4.3 固態脂質與液態脂質質量比（固液脂質比）的考察 改變固液脂質比，其他條件不變，固定脂質材料總量，固液脂質比分別為1∶0.1、1∶2.3、1∶4.6、1∶6.9、1∶9.2、1∶11.5、1∶13.8、1∶16.1，按“2.1”項下方法制備AMP-NLC，以包封率和載藥量為指標進行考察。結果表明，包封率分別為68.19%、72.39%、70.40%、75.47%、84.45%、94.52%、93.00%、82.76%，載藥量分別為0.94%、1.17%、1.46%、1.07%、1.44%、6.03%、5.83%、6.03%。不同固液脂質比1∶0.1～1∶16.1，包封率呈先增大后減小的趨勢，而載藥量呈逐漸增大的趨勢，有可能是液態脂質較多時有利于蛇葡萄素的溶解在輔料中，使得載藥量在6%左右。該因素影響顯著，選擇固液脂質比1∶0.1～1∶11.5做后續研究。

2.4.4 蛇葡萄素和總脂質比例（藥脂比）的考察 改變脂藥比，其他條件不變，固定脂質材料總量，藥脂比分別為1∶2.5、1∶5.0、1∶7.5、1∶10.0、1∶12.5、1∶15.0，按“2.1”項下方法制備AMP-NLC，以包封率和載藥量為指標進行考察。結果表明，包封率分別為76.84%、90.12%、84.56%、97.33%、78.04%、73.97%，載藥量分別為5.54%、4.54%、3.69%、3.10%、3.51%。蛇葡萄素投藥量越高載藥量越高，但過高的投藥量，制備NLC后有大量蛇葡萄素析出，影響包封率和載藥量。該因素影響顯著，選擇藥脂比1∶2.5～1∶7.5做后續研究。

2.4.5 蛋黃卵磷脂用量的考察 改變蛋黃卵磷脂用量，其他條件不變，蛋黃卵磷脂用量分別為18、21、24、27、30 mg，按“2.1”項下方法制備AMP-NLC，以包封率和載藥量為指標進行考察。結果表明，包封率分別為79.03%、97.40%、89.03%、80.80%、79.60%，載藥量分別為5.54%、4.54%、3.69%、3.10%、3.51%。隨著卵磷脂的用量逐漸增大，包封率呈先增大后減小的趨勢，載藥呈減小趨勢，根據相關文獻報道和本實驗研究發現磷脂在NLC中只是起到了助乳化劑的作用，因而其用量到達一定范圍內合適即可。該因素影響顯著，優先考慮高包封率，選擇卵磷脂的用量21～30 mg做后續研究。

2.4.6 P188用量的考察 改變P188用量，其他條件不變，P188的用量分別為0.1%、0.6%、1.0%、2.0%，按“2.1”項下方法制備AMP-NLC，以包封率和載藥量為指標進行考察。結果表明，包封率分別為55.28%、81.41%、95.72%、96.92%，載藥量分別為1.45%、3.45%、2.50%、2.44%。隨著P188用量越多，包封率逐漸增大，但是在用于制備注射劑時，其用量不能太高，所以選擇P188用量為2%。

2.4.7 有機相和水相體積比例的考察 改變有機相和水相比例其他條件不變，有機相和水相體積比分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4，按“2.1”項下方法制備AMP-NLC，以包封率和載藥量為指標進行考察。結果表明，包封率分別為79.71%、73.31%、91.50%、86.97%，載藥量分別為1.14%、2.62%、2.70%、2.71%。選擇相體積比為1∶3，其能充分溶解脂質相和藥物，有利于NLC的制備。

2.5 基于Box-Behnken響應面優化

在單因素試驗的基礎上，選擇對NLC包封率影響較大的因素作為實驗因素，選擇蛋黃卵磷脂用量（1）、藥脂比（2）和固液脂質比（3）做響應面試驗優化。采用3因素3水平的Box-Behnken響應面設計法進行優化，3因素3水平試驗設計見表1。

表1 響應面實驗設計與結果

Table 1 Design and results of response surface experimental

試驗號X1/mgX2X3Y1/%Y2/%Y3/nmY4/mVOD值 125.5 (0)1∶7.5 (0)1∶5.8 (0)60.851.71344.0?10.070.64 225.5 (0)1∶7.5 (0)1∶5.8 (0)59.981.74332.6?4.840.75 325.5 (0)1∶2.5 (?1)1∶11.5 (+1)65.004.301 679.3?6.770.00 430 (+1)1∶12.5 (+1)1∶5.8 (0)89.201.54259.6?11.970.65 525.5 (0)1∶12.5 (+1)1∶11.5 (+1)57.112.00200.4?9.750.91 621 (?1)1∶12.5 (+1)1∶5.8 (0)59.531.22257.9?16.830.54 730 (+1)1∶2.5 (?1)1∶5.8 (0)50.933.401 355.7?13.230.46 821 (?1)1∶7.5 (0)1∶11.5 (+1)97.553.73286.0?6.930.98 925.5 (0)1∶2.5 (?1)1∶0.1 (?1)48.972.00331.7?7.920.75 1025.5 (0)1∶7.5 (0)1∶5.8 (0)80.992.24365.5?7.580.70 1125.5 (0)1∶7.5 (0)1∶5.8 (0)71.192.07136.1?8.580.83 1230 (+1)1∶7.5 (0)1∶11.5 (+1)64.144.50556.2?6.770.57 1325.5 (0)1∶7.5 (0)1∶5.8 (0)54.552.01169.4?9.680.84 1421 (?1)1∶2.5 (?1)1∶5.8 (0)81.771.00181.0?6.250.95 1530 (+1)1∶7.5 (0)1∶0.1 (?1)74.002.40135.7?7.620.83 1621 (?1)1∶7.5 (0)1∶0.1 (?1)55.481.51184.6?5.790.74 1725.5 (0)1∶12.5 (+1)1∶0.1 (?1)63.960.92107.8?8.590.00

2.5.1 總評歸一法 若單以包封率（1）、載藥量（2）、粒徑（3）或ζ電位（4）為評定指標，每個指標優選的條件可能會相互矛盾，因此，實驗中常引入歸一化綜合值（outside diameter，OD值），來考察指標的綜合效果。根據Hassan方法[19]對各個指標進行歸一化處理，對于欲達到最大化的指標，如包封率、載藥量，計算方式為公式（3）；對于欲達到最小化的指標，如粒徑，計算方式為公式（4），OD值計算為公式（5）。由于各條件對PDI影響不顯著，所以未選取其作為響應值，得到的數據和結果如表1所示。

dmax＝(Y－min)/(max－min) （3）

dmin＝(max－Y)/(max－min) （4）

OD＝(d)1/n（5）

Y為實際測量值，max和min分別為各指標可接受的最大值和最小值

對于公式（3），當試驗中某指標等于或超過max將設為1，反之小于min則設為0；對于公式（4），當試驗中某指標等于或超過max將設為0，反之小于或等于min則設為1。

根據《中國藥典》2020年版要求包封率作為微粒給藥系統的主要指標其限度不低于80%，靜脈用乳狀液型注射液中90%的乳滴粒徑應在1 μm以下，除另有規定外，不得有大于5 μm的乳滴，確定納米粒最優處方粒徑范圍為250 nm以下，根據前期試驗結果確定載藥量范圍為2%～10%。

2.5.2 2次回歸模型的建立 采用Design-Expert V8.0.6軟件對1、2、3、4和OD值與1、2和3進行多元2項式方程擬合。擬合方程2均大于0.8，表明模型擬合程度較好；方差分析結果見表2，模型＜0.05，具有顯著性差異，失擬項＞0.05，表明失擬不顯著。擬合方程分別為1＝400.29－26.041－6.292＋1.533＋0.3412－0.05113－0.0123＋0.4612－0.0522，2＝0.814 5，＝0.025 7；2＝2.677 761－0.411 952－0.000 063－0.011 5612－0.000 0113－0.000 0523＋0.013 9912－0.000 0422＋0.000 0232，2＝0.956 2，＝0.000 6；3＝?2 339.45＋118.531＋84.452＋3.113－6.5212＋0.3113＋0.5523＋2.6522＋0.0132，2＝0.893 0，＝0.003 5；4＝?8.15－0.471－1.622－0.0373＋2.9612－0.5013－0.5823－1.2212－2.722＋2.5932，2＝0.850 6，＝0.031 3；OD＝5.924 31－0.364 971－0.057 692－0.000 563＋0.000 3312－0.000 0513＋0.000 0723＋0.000 6312－0.000 2322－0.000 00332，2＝0.959 4，＝0.000 4。以OD值為評價指標對交互關系的響應面2D和3D效果圖見圖2。

表2 方差分析結果(OD值)

Table 2 ANOVA results (OD value)

誤差來源自由度離均差平方和F值P值誤差來源自由度離均差平方和F值P值 模型91.2518.370.000 4X1210.079.250.018 8 X110.068.250.023 9X2210.2330.410.000 9 X210.000.070.805 0X3210.056.080.043 0 X310.000.260.623 5殘差70.053 X1X210.0911.830.010 8擬失項30.0220.920.508 3 X1X310.068.450.022 8純誤差40.031 X2X310.6991.65＜0.000 1總誤差161.30

圖2 因素間交互作用的響應面2D圖和3D圖(OD值)

2.5.3 最優處方的驗證 根據軟件預測結果，最終優化后處方為固液脂質比（山崳酸甘油酯與中鏈三酰甘油的比例）為1∶11.5，藥脂比為1∶10.5，蛋黃卵磷脂用量為21 mg，P188的用量為2%，計算軟件預測值和實測值的相對偏差計算為公式（6），結果如表3。實驗結果表明，除載藥量和OD值外，包封率、粒徑和ζ電位的偏差均在±10%左右，可能是在制備過程中，使用的磁力攪拌器雖然都調節到同一位置，但是其攪拌速度還是有一定偏差；此外，水浴鍋70 ℃溫度并不能保持恒定，溫度有一定變化會影響AMP-NLC制備。

相對偏差＝|預測值－實測值|/預測值 （6）

2.6 質量表征

2.6.1 粒徑和ζ電位的測定 取AMP-NLC稀釋至20倍，于馬爾文粒度儀測定其粒徑為（156.50±7.11）nm、ζ電位為（?11.00±0.95）mV，結果見圖3-A、B。

2.6.2 DSC分析 取蛇葡萄素粉末、AMP-NLC和NLC凍干粉末進行DSC測定，DSC掃描條件為氮氣，掃描溫度30～300 ℃，升溫速率10 ℃/min，氣體體積流量50 mL/min，結果見圖4。吸熱谷是蛇葡萄素的熔化過程、而放熱峰是蛇葡萄素的晶化過程，從這些熱動力學中計算熔融焓（Δfusion）和結晶焓（Δcryst）。DSC熱譜圖中，蛇葡萄素的熔點為248.5 ℃（Δfusion＝91.89 J/g），此外，DSC熱譜圖出現3個吸熱峰和1個放熱峰，和文獻報道[20]比對，前2個吸熱峰分別為93.17 ℃（Δfusion＝80.38 J/g）和141.5 ℃（Δfusion＝23.80 J/g），有可能是2次脫水導致。制備成NLC以后，蛇葡萄素的248.5 ℃尖銳峰消失，按照相關文獻[21]推測有可能是藥物被完全包裹在基質中呈無定型，且表面無藥物粒子存在，表明蛇葡萄素包裹在NLC里。

2.6.3 XRD分析 取蛇葡萄素粉末、AMP-NLC和NLC凍干粉末進行XRD測定，測定條件：Cu Kα輻射（0.154 056 nm），掃描范圍5°～45°，掃描速率5°/min，結果見圖5。結果表明，蛇葡萄素自身有很多衍射峰，而制備成NLC后，只形成了2個獨特的衍射峰，分別是23.16°和19.03°，其形成一定的結晶結構。這與DSC結果一致，說明蛇葡萄素大多是以無定型狀態被包裹于制劑中。

表3 最優處方的驗證

Table 3 Validation of optimal prescription

參數包封率/%載藥量/%粒徑/nmζ電位/mVOD值 實測值81.71±1.763.86±0.22156.50±7.11?11.00±0.950.88±0.03 預測值82.733.11174.99?10.511.08 相對偏差/%1.2324.2210.564.6618.51

圖3 AMP-NLC的粒徑分布(A) 和ζ電位(B)

圖4 AMP-NLC的DSC圖

2.6.4 FT-IR的測定 取蛇葡萄素粉末、AMP- NLC、NLC凍干粉末、蛇葡萄素粉末與NLC凍干粉末的物理混合物適量分別與100 mg溴化鉀基質混合研磨，10 MPa下壓成薄片，置于紅外光譜儀下掃描，結果見圖6。結果表明，制備成AMP-NLC后蛇葡萄素的特征峰1640 cm?1（C＝O）消失，表明成功將蛇葡萄素包裹在NLC中，形成AMP-NLC。

2.6.5 TEM和SEM形態觀察 取新制備的AMP- NLC用水適當稀釋，取少許滴至鋪有碳膜的銅網上，用2%磷鎢酸染色，晾干后，用TEM下觀察并拍照，結果見圖7-A。取一定量凍干AMP-NLC粉末于真空條件下噴金后置于SEM下觀察，結果見圖7-B。結果表明，制備成AMP-NLC成類球形，粒徑在150 nm左右。

圖5 AMP-NLC的XRD圖

圖6 AMP-NLC的FT-IR圖

2.6.6 體外釋藥特性研究 取AMP-NLC 1 mL放入活化的透析袋（截留相對分子質量8×106～1×107）中，兩端扎緊，置于10 mL的pH為5.0的PBS釋放介質中，于（37.0±0.5）℃恒溫振蕩器中，分別在0.5、1.0、1.5、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、24.0、48.0、72.0 h取1 mL釋放液，并補充等量等溫的釋放介質。取出的釋放液補加0.5 mL甲醇混勻，再過0.22 μm濾膜，按“2.2.2”下方法測定，記錄峰面積，計數累積釋放率，繪制釋放曲線見圖8，并進行釋藥數學模型擬合，擬合結果見表4。結果表明，經制備成NLC，0.5 h內不存在突釋，且在12 h內成緩釋作用，12 h釋放率達45%。此外，蛇葡萄素和AMP-NLC在一級和Riger-Peppas釋放模型中擬合度均很高，2均達到0.80以上，經過制備成NLC，未改變其釋放模式，但在體外釋放呈緩慢釋放，表明經制備成AMP-NLC，能起到緩釋作用。板，2000個/孔，每孔100 μL，置于細胞培養箱37 ℃、5% CO2待貼壁。貼壁后，棄去舊培養基，加入用無血清培養基配制的質量濃度為10、20、40、80、100 μg/mL蛇葡萄素和AMP-NLC，每組設置3個復孔，置于細胞培養箱孵育24 h后，棄去藥液，加入MTT工作液（5 mg/mL）100 μL，置于細胞培養箱孵育4 h，后加入100 μL DMSO，于490 nm處測定吸光度，計算其半數抑制濃度（inhibitory concentration of 50%，IC50）。結果表明，蛇葡萄素和AMP-NLC的IC50分別為44.51、41.51 μg/mL。

圖7 AMP-NLC的TEM (A) 和SEM (B) 圖

2.6.7 MTT試驗 將SMMC-7721細胞接種于96孔

圖8 蛇葡萄素和AMP-NLC體外釋放曲線(, n = 3)

表4 蛇葡萄素和AMP-NLC的釋藥模型擬合方程

Table 4 Drug release model fitting equations of AMP and AMP-NLC

藥物方程擬合方程 蛇葡萄素零級方程Q＝1.582 3 t，R2＝0.322 3 一級方程Q＝70.51(1－e?2.59 t)，R2＝0.988 0 Riger-Peppas方程Q＝64.00 t0.035 4，R2＝0.959 8 AMP-NLC零級方程Q＝1.10 t，R2＝0.455 3 一級方程Q＝47.93 (1－e?0.625 2 t)，R2＝0.948 2 Riger-Peppas方程Q＝29.43 t0.157 3，R2＝0.903 0

2.6.8 攝取情況考察 將SMMC-7721細胞接種于12孔板，10 000個/孔，每孔500 μL，以RhB作為對照，給藥組為RhB-NLC置于細胞培養箱孵育12、24 h后，棄去藥液，用預冷PBS洗2次，加入Hoechst33342染料染色30 min，再用預冷PBS洗2次，于倒置熒光顯微鏡下觀察攝取情況（圖9）。結果表明，RhB-NLC在SMMC-7721細胞中熒光強度高于RhB組，表明NLC對SMMC-7721細胞有一定被動攝取作用。

3 討論

蛇葡萄素作為一種具有生物活性的重要天然黃酮類成分，近年來受到越來越多國內外學者的關注。然而，較低的水溶性和膜滲透性使其成藥性不佳，很大程度上限制了蛇葡萄素口服制劑的研發。注射給藥也因藥物穩定性差而具有一定局限性。在本研究中，設計了一種新型納米結構脂質載體來研究其在提高藥物成藥性能以及對體外細胞攝取的影響。

NLC能使難溶性藥物的溶解度增加，且提高藥物的包封率和載藥量[22-23]。在初步試驗中，選擇了幾種常用的液態脂質進行溶解度篩選。研究結果表明蛇葡萄素在中鏈三酰甘油中的溶解度最高，且制備的NLC包封率最高，而油酸對于屬于酸性藥物的蛇葡萄素來說，并不適合用其制備成NLC，文獻報道堿性藥物吳茱萸堿[24]使用油酸制備NLC的效果更為理想。因此，最終選擇中鏈三酰甘油用于制備AMP-NLC。山崳酸甘油酯比高熔點脂類單硬脂酸甘油酯具有更適合的親水親油平衡值（hydrophile lipophilic balance，HLB），使它更容易負載水微溶性的蛇葡萄素。山崳酸甘油酯制備的AMP-NLC比其他固態脂質制備的NLC包封率更高且更穩定。NLC中液體脂質和固體脂質的組合比例至關重要，蛋黃卵磷脂可作為一種助溶劑，隨著其用量越大，包封率逐漸降低，故選擇最大為30 mg蛋黃卵磷脂進行優化。P188作為一種表面活性劑，用量越大，包封率和載藥量也不斷增加，但是用于iv時，其用量是有一定要求，故選擇最大為2%進行優化。蛇葡萄素微溶于水，具有中等的油水分配系數，這些特性使得蛇葡萄素與常用液體油相的兼容性較差。在選擇輔料的基礎上，制備的AMP-NLC在一定程度上提高了蛇葡萄素的包封率和載藥量。

圖9 SMMC-7721對RhB-NLC的攝取情況

NLC結構可分為3種：缺陷型、無定型和多層結構型。較高濃度的液態脂質會產生無定型結構，在這種結構中，α-型到β-型的結晶過程不會發生，從而防止藥物在儲存期間釋放[25]，從本實驗結果推測，所制備的AMP-NLC應屬于無定型。目前，尚未有蛇葡萄直接制備成NLC，但有郜娜等[13]研究先將其制備成磷脂復合物再制備成NLC，相對其制備步驟，本工藝更為簡捷，且優化的AMP-NLC粒徑更小，包封率更高（達到80%以上），因此推測該制劑可能更有利于iv給藥。XRD表征表明，經過制備成AMP-NLC，蛇葡萄素自身的衍射信號消失，在19°和23°產生新的衍射峰，表明AMP-NLC經過凍干后形成了新的晶型。在TEM下可觀察到AMP-NLC呈球形或類球形分布，粒徑約為100 nm，且外層有一層脂質層包裹，有可能是中鏈三酰甘油、蛋黃卵磷脂和山崳酸甘油酯形成一層脂質結構在外層。此外，AMP-NLC的Riger-Peppas釋藥模型擬合度較高，參考同為Riger-Peppas釋放模型的溫敏型納米凝膠[26]，蛇葡萄素可能被脂質包裹，藥物可能經過這層脂質中釋放，再經過外層中擴散滲透，則釋放變得緩慢。

本研究采用單因素實驗結合Box-Behnken響應面法優化處方工藝，成功地制備了AMP-NLC，對其進行包封率及載藥量、粒徑及Zeta電位、電鏡形態、DSC、XRD、IR及體外釋放度等質量表征，用MTT法研究了其對SMMC-7721細胞的抑制作用，與原料藥相比，AMP-NLC對SMMC-7721細胞具有更高的抑制活性，并評估了SMMC-7721細胞攝取的能力。相對來說，本研究所設計制備的AMP-NLC具有顯著的緩釋效應和較高的穩定性，AMP-NLC制備工藝更為簡單，包封率及載藥量更高、粒徑更小，從而利于體內注射給藥。AMP-NLC顯著改善了SMMC-7721細胞對蛇葡萄素的體外攝取，從而增強了對SMMC-7721的抑制作用。上述研究結果表明納米結構脂質載體是一種適合蛇葡萄素注射給藥的理想納米遞藥載體，為AMP-NLC后續的體內藥效學、靶向性及藥動學等研究奠定基礎，同時也為壯藥甜茶藤中蛇葡萄素的新制劑研發提供了有益的探索。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 清·劉善述. 趙素云等整理. 草木便方 [M]. 重慶: 重慶出版社, 1988: 181.

[2] 何桂霞, 裴剛, 周天達, 等. 顯齒蛇葡萄中總黃酮和二氫楊梅素的含量測定 [J]. 中國中藥雜志, 2000, 25(7): 423-425.

[3] 廣西壯族自治區食品藥品管理局. 廣西壯族自治區壯藥質量標準 [M]. 南寧: 廣西科學技術出版社, 2011: 178.

[4] Sayed A M, Hassanein E H M, Salem S H,. Flavonoids-mediated SIRT1 signaling activation in hepatic disorders [J]., 2020, 259: 118173.

[5] 李雪暉. 二氫楊梅素抗氧化功能研究 [J]. 云南化工, 2018, 45(7): 64-65.

[6] 謝俊杰, 阮兆娟, 左國營. 蛇葡萄素與8種抗生素聯用的體外抗銅綠假單胞菌作用研究 [J]. 中國藥房, 2019, 30(1): 21-25.

[7] 胡琴. 二氫楊梅素通過Nrf2抑制NLRP3炎性體調控的血管內皮細胞焦亡的作用及機制研究 [D]. 重慶: 第三軍醫大學, 2017.

[8] 豐潔, 賀桂瓊. 二氫楊梅素對APP/PS1轉基因小鼠抗炎的作用及其機制初探 [J]. 免疫學雜志, 2017, 33(4): 301-305.

[9] Tong H H, Zhang X J, Tan L F,. Multitarget and promising role of dihydromyricetin in the treatment of metabolic diseases [J]., 2020, 870: 172888.

[10] Sun C C, Su H, Zheng G D,. Fabrication and characterization of dihydromyricetin encapsulated zein- caseinate nanoparticles and its bioavailability in rat [J]., 2020, 330: 127245.

[11] 吳曉珊, 倪峰, 高毓瀅, 等. 新型蛇葡萄素衍生物γ-聚谷氨酸蛇葡萄素酯的合成、表征及抗腫瘤作用評價 [J]. 中國藥房, 2020, 31(22): 2720-2725.

[12] 張文娟, 陳一楨, 唐蘭如, 等. 二氫楊梅素長循環納米脂質體的制備及大鼠體內藥動學研究 [J]. 中草藥, 2018, 49(4): 806-813.

[13] 郜娜, 范明松, 楊慶宇, 等.二氫楊梅素磷脂復合物納米結構脂質載體的制備、表征及藥動學研究 [J]. 中草藥, 2019, 50(17): 4060-4067.

[14] 黃娟, 岳晶晶, 馮璇, 等. 二氫楊梅素固體自微乳的制備及表征[J/OL]. 食品科學, [2022-03-28]. http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.2206.TS.20211220.1742. 038.html.

[15] Castillo R R, Vallet-Regí M. Functional mesoporous silica nanocomposites: Biomedical applications and biosafety [J]., 2019, doi: 10.3390/ijms 20040929.

[16] Jansook P, Fül?p Z, Ritthidej G C. Amphotericin B loaded solid lipid nanoparticles (SLNs) and nanostructured lipid carrier (NLCs): Physicochemical and solid-solution state characterizations [J]., 2019, 45(4): 560-567.

[17] Gomaa E, Fathi H A, Eissa N G,. Methods for preparation of nanostructured lipid carriers [J]., 2022, 199: 3-8.

[18] Anantaworasakul P, Chaiyana W, Michniak-Kohn B B,. Enhanced transdermal delivery of concentrated capsaicin from chili extract-loaded lipid nanoparticles with reduced skin irritation [J]., 2020, 12(5): 463.

[19] Hassan E, Parish R, Gallo J. Optimized formulation of magnetic chitosan microspheres containing the anticancer agent, oxantrazole [J]., 1992, 9(3): 390-397.

[20] Wang C G, Xiong W, Reddy Perumalla S,. Solid- state characterization of optically pure (+)dihydromyricetinextracted fromleaves [J]., 2016, 511(1): 245-252.

[21] Chaudhari V S, Murty U S, Banerjee S. Nanostructured lipid carriers as a strategy for encapsulation of active plant constituents: Formulation andphysicochemical characterizations [J]., 2021, 235: 105037.

[22] 管慶霞, 張偉兵, 張喜武, 等. 馬錢子堿納米結構脂質載體處方與制備工藝的優化 [J]. 中草藥, 2018, 49(11): 2557-2563.

[23] 王小霞, 張智強. 鞣花酸納米結構脂質載體處方優化和口服生物利用度研究 [J]. 中草藥, 2021, 52(13): 3862-3871.

[24] 董丹丹, 焦紅軍, 郝海軍, 等. 吳茱萸堿納米結構脂質載體處方優化和SD大鼠體內口服藥動學研究 [J]. 中草藥, 2022, 53(1): 60-70.

[25] Fonseca-Santos B, Silva P B, Rigon R B,. Formulating SLN and NLC as innovative drug delivery systems for non-invasive routes of drug administration [J]., 2020, 27(22): 3623-3656.

[26] 莫鎮杰. 環境響應型納米滴眼液的制備與評價 [D].廣州: 廣東藥科大學, 2019.

Formulation optimization of ampelopsin nanostructured lipid carriers by Box-Behnken response surface method andevaluation

MAI Wan-ting1, 4, ZHONG Hua-shuai1, SU Xiao-dan1, LU Jian-mei1, QIN Yu-cui1, HUANG Qiu-jie2, YE Yong1, 3

1.Pharmaceutical College, Guangxi Medical University, Nanning 530021, China 2. Pharmaceutical College, Guangxi University of Chinese medicine, Nanning 530001, China 3. Guangxi Key Laboratory of Bioactive Molecules Research and Evaluation, Nanning 530021, China 4. Guigang City People’s Hospital, Guigang 537100, China

To optimize the formulation of ampelopsin nanostructured lipid carriers (AMP-NLC) and to characterize its quality, and to study its inhibitory effect on SMMC-7721 cells and its uptake.AMP-NLC was prepared by organic solvent evaporation, and based on the single factor test combined with Box-Behnken response surface, the AMP-NLC prescription was optimized and its quality was characterized. The IC50of SMMC-7721 was measured by MTT method, and the uptake of SMMC-7721 cells was observed by rhodamine B dye.The optimal formula was that the ratio of glyceryl behenate to medium chain triglyceride was 1:11.5, the ratio of drug to lipid was 1:10.5, the dosage of egg yolk lecithin was 21 mg and the dosage of P188 was 2%, respectively. The average encapsulation efficiency of AMP-NLC was (81.71 ± 1.76)%, the average drug loading was (3.86 ± 0.22)%, the average particle size was (156.50 ± 7.11) nm and the zeta potential was (?11.00 ± 0.95) mV. Thedrug release process conformed to the primary release model= 47.93(1－e?0.625 2 t). The IC50of ampelopsin and AMP-NLC for SMMC-7721 cells were 44.51 and 41.51 μg/mL, and compared with ampelopsin, SMMC-7721 cells had a better uptake to AMP-NLC.The model established by Box-Behnken design-response surface could be employed to optimize the formulation of AMP-NLC, and AMP-NLC could effectively improve the relative uptake of ampelopsin in SMMC-7721 cells.

ampelopsin; Box-Behnken response surface optimization; nanostructured lipid carriers; quality evaluation; cellular uptake;targeting

R283.6

A

0253 - 2670(2022)16 - 4982 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.16.007

2022-02-16

國家自然科學基金資助項目（81960756）；廣西自然科學基金資助項目（2022GXNSFDA035063）；廣西自然科學基金資助項目（2018GXNSFAA050078）；廣西高校中青年教師科研基礎能力提升基金資助項目（2019KY0148）；廣西高校中青年教師科研基礎能力提升基金資助項目（2019KY0315）

麥琬婷（1995—），女，碩士研究生，研究方向為中藥新劑型與新技術。E-mail: 347800540@qq.com

黃秋潔（1979—），女，副教授，主要從事中藥新劑型與新技術研究。E-mail: hqj8@163.com

葉 勇（1979—），男，博士，副教授，主要從事民族藥藥效物質及其新制劑研究。E-mail: yong-ye@163.com

#共同第一作者：鐘華帥（1997—），男，碩士研究生，研究方向為中藥新劑型與新技術。E-mail: 2143327747@qq.com

[責任編輯 鄭禮勝]