Nrf2抑制劑ML-385腹腔注射對小鼠乳腺癌骨轉移的抑制作用及其與骨橋蛋白的關系

殷玉琨，陳佳陽，劉麗星，江正龍，常金圓，李杰，馮利

國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫學研究中心/中國醫學科學院

北京協和醫學院腫瘤醫院中醫科，北京 100021

乳腺癌在女性惡性腫瘤中的發病率位居第一，晚期乳腺癌患者多發生遠處轉移，骨骼是其最常轉移的部位，約75%的Ⅳ期乳腺癌患者會發生骨轉移［1-2］。乳腺癌患者一旦發生骨轉移，會繼發疼痛、骨折等［3］。目前乳腺癌骨轉移的主要治療方法是雙膦酸鹽、放療等，但效果不夠滿意，因此臨床亟需尋求新的針對乳腺癌骨轉移的治療手段及藥物［4］。研究顯示，乳腺癌轉移灶細胞質及細胞核中的核因子紅細胞相關因子2（Nrf2）表達高于原發灶，尤其以腦轉移灶表達最高，但其在骨轉移病灶中的表達鮮見報道［5］。骨橋蛋白（OPN）高表達與乳腺癌骨轉移相關，敲低乳腺癌細胞OPN 表達可產生較強的抗細胞遷徙及抗克隆形成作用［6］。研究顯示，Nrf2 與OPN表達呈正相關關系［7-8］。但是，目前關于Nrf2 在乳腺癌骨轉移組織中的表達變化及其是否通過OPN 發揮干預骨轉移的作用尚未可知。2020年1月—2021年6 月，本研究觀察了Nrf2 抑制劑ML-385 對乳腺癌小鼠骨轉移及OPN 表達的抑制作用，以期為乳腺癌骨轉移的治療提供新思路。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：雌性BABL/c 小鼠40 只，5周齡，體質量16～18 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK（京）2019-0008，動物質量合格證編號：1103222011006754，在SPF 環境下飼養。腫瘤細胞株：小鼠親骨性乳腺癌高轉移細胞株4T1.2 購自北京端點醫藥細胞庫，使用含10%胎牛血清及青—鏈霉素（各50 U/mL）的MEM 培養基進行培養，細胞培養環境為37 ℃、5% CO2。藥物：ML385購自美國APExBIO公司。

1.2 動物分組及處理方法 將40只雌性BABL/c小鼠隨機分為空白組、假手術組、模型組、治療組，每組10只。分組處理前兩周復蘇4T1.2細胞，適應性傳代培養兩代后，進行細胞擴增培養；兩周后將對數生長期的4T1.2細胞用胰酶消化，獲取細胞沉淀，用生理鹽水將細胞沉淀重懸，1 000 r/min離心5 min，棄去上清；重復清洗操作3遍后，調整細胞密度為3.4×105/mL；取1 mL細胞懸液置于1.5 mL無菌細胞管，冰盒中保存，吸取使用時顛倒混勻。模型組、治療組采用脛骨種植4T1.2細胞的方法制備乳腺癌骨轉移模型［8］。假手術組僅打孔，不注射4T1.2細胞懸液；空白對照組正常飼養。建模后第1天治療組腹腔注射溶于DMSO的ML385 20 mg/kg，空白組、假手術組、模型組腹腔注射等量生理鹽水，1次/天，連續注射28 d。

1.3 成瘤情況及脛骨瘤重觀察 將各組小鼠處死，記錄模型組和治療組的成瘤情況，并稱取脛骨瘤重。

1.4 脛骨組織骨質改變情況觀察 采用Micro-CT檢查。取各組雙側脛骨，使用Micro-CT 進行掃描，SkyScan NRecon software 軟件重建成三維結構，觀察骨質改變情況。采用SkyScan CT-Analyser（CTAn）軟件分析骨質相關指標，包括松質骨及皮質骨的骨體積分數（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁數目（Tb.N）及骨小梁間隙（Tb.Sp）。

1.5 脛骨組織病理觀察 采用HE 染色。取各組小鼠的部分脛骨組織，經固定、脫鈣處理后，石蠟包埋、切片。脫蠟至水，將切片加入蘇木素染液染色3～5 min，自來水洗，分化液分化，自來水沖洗，返藍液返藍，流水沖洗。切片依次加入85%、95%的梯度乙醇脫水各5 min，加入伊紅染液中染色5 min。脫水封片，顯微鏡下觀察脛骨組織病理改變。

1.6 脛骨組織Nrf2、OPN 表達檢測 采用免疫組化法。將各組小鼠的脛骨組織石蠟切片置于30%乙醇中，抗原修復后，3%過氧化氫封閉液封閉15 min，PBS 清洗，滴加一抗，4 ℃孵育過夜。次日切片復溫20～30 min，PBS 清洗，滴加二抗；置于濕盒內，室溫孵育20 min，PBS 清洗，DAB 染色后再清洗；蘇木素輕度復染30～50 s，去離子水洗3 次，鹽酸乙醇中浸泡后自來水沖洗30 min。乙醇脫水，中性樹脂膠封片。Nrf2 表達于細胞質、細胞核，OPN表達于細胞膜、細胞質及細胞外基質，棕色顆粒為表達陽性。使用組織切片數字掃描儀及成像系統采集免疫組化切片上的掃描圖像，利用圖像分析系統自動讀取組織測量區域，分析測量區域內陽性細胞數、總細胞數，計算陽性率。陽性率=陽性細胞數/總細胞數×100%。

1.7 統計學方法 采用SPSS17.0 統計軟件。計量資料采用S-W 正態性檢驗，呈正態分布以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，重復測量數據采用重復測量的方差分析；非正態分布以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

空白組、假手術組無小鼠死亡，模型組及治療組均有1只小鼠死亡。

2.1 模型組與治療組小鼠脛骨成瘤情況及瘤重比較 模型組及治療組小鼠脛骨成瘤率均為100%，脛骨瘤重分別為（0.921 0 ± 0.358 2）、（0.575 1 ±0.2283）g，兩組比較P<0.05。

2.2 各組小鼠脛骨組織骨質變化比較 Micro-CT三維重建結果顯示，空白組及假手術組骨質無明顯改變，模型組存在明顯骨質破壞，治療組骨質破壞程度較模型組減輕，見OSID 碼圖1。各組小鼠脛骨組織骨質相關指標比較見表1。

表1 各組小鼠脛骨組織BV/TV、Tb.Th、Tb.N及Tb.Sp比較（±s）

表1 各組小鼠脛骨組織BV/TV、Tb.Th、Tb.N及Tb.Sp比較（±s）

注：與假手術組和空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

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2.3 各組小鼠脛骨組織病理學變化比較 空白組與假手術組小鼠脛骨組織未見明顯異常。模型組小鼠脛骨骨髓腔內可見大量核大、深染、核仁明顯的細胞，細胞質空，附近可見壞死區，伴出血，骨皮質見編織骨大量形成；治療組小鼠上述脛骨組織病理學改變較模型組減輕。見OSID碼圖2。

2.4 各組小鼠脛骨組織Nrf2 及OPN 陽性率比較 見表2、OSID碼圖3。

表2 各組小鼠脛骨組織Nrf2及OPN陽性率比較（%，±s）

表2 各組小鼠脛骨組織Nrf2及OPN陽性率比較（%，±s）

注：與假手術組和空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

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3 討論

腫瘤細胞多數處于氧化應激狀態，內源性Nrf2/ARE 信號通路與腫瘤的發生密切相關［9］。研究顯示，腫瘤的活性氧（ROS）水平明顯高于正常細胞，其機制可能與遺傳分子生物學改變、腫瘤細胞較高的代謝率、炎癥因子的參與及抗腫瘤藥物的使用有關，這些ROS 可通過脂質過氧化、DNA 損傷和蛋白質破壞而參與腫瘤的形成［10］。過量的ROS 可導致腫瘤細胞氧化應激水平升高。Nrf2/ARE 是機體內重要的抗氧化信號通路，當其被激活時可調控下游抗氧化蛋白表達，從而保持機體免受ROS 的侵害［9］。多項研究顯示，乳腺癌、肺癌等腫瘤組織Nrf2 表達明顯升高，并提示患者預后不良［9，11］。研究證實，與Nrf2 競爭性拮抗Keap1 可導致細胞核內Nrf2 表達升高，從而抑制腫瘤細胞凋亡，促進腫瘤生長及轉移［12］。有研究顯示，蛹蟲草菌素可通過調控Nrf2 的表達，而發揮放療增敏的效果［13］。以上研究提示，Nrf2參與介導的氧化應激反應可能是治療腫瘤轉移的新切入點。

OPN 在乳腺癌骨轉移組織中高表達，而高表達的OPN 不僅可以促進骨吸收，還能夠促進癌癥發展和腫瘤骨轉移［14］。OPN 高表達的晚期乳腺癌患者預后更差，與健康志愿者相比，骨轉移的乳腺癌患者血漿OPN 水平明顯升高，并且與患者生存時間縮短相關［15］。研究顯示，OPN 高表達的乳腺癌患者生存時間較OPN 低表達患者短約21 個月［16］。有研究采用qRT-PCR 法檢測顯示，三種易發生骨轉移的乳腺癌 細 胞系MDA-231-BoM-1833 細胞、4T1.2 細 胞和Py8119 細胞中的OPN mRNA 表達顯著高于其親本細胞系中的mRNA 表達［17］。還有研究表明，部分敲除OPN 可通過囊泡形成引起全基因組表達變化，雖然抗細胞增殖作用不是很明顯，但具有明顯的抗細胞遷移和抗細胞克隆作用，并可以部分或完全緩解軟組織和溶骨性病變，從而抑制乳腺癌骨轉移的發生［18］。因 此，OPN 在 乳腺癌骨轉移中 具有關鍵作用。

本研究結果顯示，模型組及治療組小鼠脛骨種植親骨乳腺癌細胞后均形成骨轉移瘤，但治療組瘤重較小，且HE 染色顯示骨組織破壞程度較模型組相對減輕，提示抑制Nrf2 表達可有效抑制乳腺癌骨轉移。BV/TV 反映骨組織容量，Tb.Th 反映骨小梁厚度，Tb. N 反映骨小梁數目，Tb. Sp 反映骨小梁間隙。本研究結果顯示，模型組BV/TV 較假手術組升高，為腫瘤體積增大所致，而治療組較模型組降低，考慮腫瘤內部骨組織成分相對較少；各組Tb.N比較無統計學差異，說明腫瘤對骨小梁數目影響不大；模型組Tb.Sp、Tb.Th 較假手術組升高，考慮與瘤體膨出導致整體體積增大有關，而治療組Tb. Sp 及Tb.Th 均較模型組降低，考慮為瘤體較小的結果。由此可見，Nrf2抑制劑ML-385可降低乳腺癌骨轉移小鼠的骨質破壞。本研究免疫組化結果顯示，模型組小鼠脛骨組織Nrf2 及OPN 陽性率較假手術組和空白組升高，而治療組均較模型組降低，提示ML-385 可能是通過抑制OPN 表達而抑制乳腺癌小鼠骨轉移的。

綜上所述，Nrf2抑制劑ML-385可抑制乳腺癌小鼠的骨轉移，下調OPN 表達是其可能的作用機制。本研究從氧化應激角度提出了治療乳腺癌骨轉移的新方向，未來需進一步從人群、體內、體外多角度深入研究其可能的機制。