恩格列凈灌胃對急性心肌梗死小鼠心功能的改善作用及其機制

李彬，于翔

天津醫科大學朱憲彝紀念醫院心血管內科天津市內分泌研究所國家衛生健康委員會激素與發育重點實驗室天津市代謝性疾病重點實驗室，天津 300134

急性心肌梗死（AMI）后心室重構是心力衰竭和心源性猝死發生發展的基礎［1］。隨著心臟介入技術的快速發展，早期血運重建可以有效挽救瀕死的心肌，但仍有大部分患者由于各種原因未能及時完成血運重建，導致心肌細胞發生不可逆的死亡，引起心室重構，最終發展為心力衰竭（HF）。炎癥在AMI的發生發展中起著重要作用［2］。RIDKER等［3］研究結果表明，以核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（NL?RP3）炎癥小體和白細胞介素1β（IL-1β）為治療靶點的Canakinumab 可能對患者有效。然而，Canakinumab價格昂貴，不太可能廣泛應用于AMI 的治療。恩格列凈是一種高選擇性鈉—葡萄糖共轉運蛋白2（SGLT-2）抑制劑，是一類新型降糖藥物，可通過抑制SGLT-2 的轉運而減少腎臟對葡萄糖重吸收，增加尿糖排泄，進而降低血糖［4］。SGLT-2 抑制劑除了能有效降低血糖和糖化血紅蛋白，還能減輕體質量、降低血壓和尿蛋白、延緩腎臟損害，從而預防2型糖尿病心血管事件的發生。研究顯示，SGLT-2 抑制劑可以通過抑制活性氧（ROS）/NLRP3/半胱氨酸蛋白酶1（Caspase-1）信號通路來抑制動脈粥樣硬化的炎癥反應［5］。SGLT-2 抑制劑還可以抑制NLRP3/凋亡相關微粒蛋白（ASC）通路激活，減輕2 型糖尿病小鼠糖尿病性心肌病的發展［6］。目前，關于SGLT-2 抑制劑對AMI 作用的研究較少。2020 年10 月—11 月，本研究觀察了恩格列凈對AMI 小鼠心功能的影響，并探討其機制是否與NLRP3/ASC/Caspase-1 信號通路有關。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：雄性C57BL/6J 小鼠34 只，6周齡，均購自北京斯貝福生物科技有限公司；給予普通飼料喂養，動物室內溫度為24 ℃，每日光照時間為12 h。主要藥物：恩格列凈購自德國勃林格殷格翰藥業有限公司。主要試劑：TUNEL試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE 凝膠快速制備試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液及NLRP3、ASC、Caspase-1、裂解的半胱氨酸蛋白酶1（cleaved Caspase-1）、IL-1β、白細胞介素18（IL-18）、羊抗兔IgG-HRP、β-actin抗體均購自中國萬類生物科技有限公司；NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-18、IL-1β及C反應蛋白（CRP）ELISA試劑盒均購自中國上海嵐派生物科技有限公司。

1.2 動物分組及處理方法 將34只C57BL/6J小鼠隨機分為假手術組11 只、模型組11 只和治療組12只。模型組與治療組建立AMI模型，方法如下：將小鼠置于氣體麻醉誘導箱內誘導麻醉，取仰臥位，四肢固定于簡易手術臺上，采用2%異氟醚（0.3 mL/min）經鼻吸入維持麻醉；左胸部去毛、消毒，暴露左胸第4 肋間隙，行1 cm 左右皮膚切口，將縫線穿過切口皮膚做縫合前狀態，逐層分離皮膚、皮下組織、肌層，暴露心臟，迅速將心臟擠出胸腔，用6-0 無菌縫合線穿過小鼠左心耳下方2～3 mm 處左冠狀動脈前降支，并進行結扎；觀察結扎部位，以遠端心肌變成蒼白色提示造模成功；將心臟迅速回納至胸腔，逐層縫合。假手術組只穿線不結扎。治療組于建型后4 h 給予恩格列凈10 mg/（kg·d）灌胃，連續7 d。假手術組及模型組分別給予等量0.5%羥乙基纖維素灌胃。

1.3 心功能觀察 采用超聲心動圖檢查。各組分別于分組處理后進行超聲心動圖檢查，采用Vevo2100高分辨率超聲顯像儀，探頭頻率30 MHz，在胸骨旁長軸切面使用M 型超聲心動圖測量左心室收縮末期內徑（LVIDs）、左心室舒張末期內徑（LVIDd）、左心室射血分數（LVEF）和短軸縮短率（FS），所有參數取3個連續心動周期的平均值。

1.4 心臟組織細胞凋亡情況觀察 采用TUNEL染色。各組小鼠分組處理后經內眥靜脈采血，3 000 r/min離心10 min，分離血清后置于?80 ℃保存。頸椎脫臼法處死小鼠后取心臟，4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋，4 μm 厚度切片。二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，PBS洗滌。將切片與50 μL TUNEL 反應液在37 ℃黑暗條 件下 孵育90 min，PBS 洗 滌3 次，DAPI 染 核10 min。封片后用熒光顯微鏡記錄并拍照，藍染代表總細胞核，紅色熒光代表凋亡細胞核，即為陽性細胞。心肌組織細胞凋亡率=凋亡細胞核數/總細胞核數×100%。

1.5 血 清NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18、CRP 水平檢測 采用ELISA 法。取各組?80 ℃冰箱保存的血清，按照ELISA 試劑盒說明書檢測血清NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18、CRP水平。

1.6 心肌組織中NLRP3、ASC、Caspase-1、cleaved Caspase-1、IL-1β、IL-18 表 達 檢 測 采 用Western blotting 法。取各組心肌組織，加入RIPA 緩沖液裂解，4 ℃條件下12 000 r/min 離心10 min，分離上清提取蛋白質，BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。制備SDS-PAGE 凝膠，將蛋白上樣液分離后轉印至PVDF 膜進行封閉。4 ℃條件下分別加入NL?RP3、ASC、Caspase-1、cleaved Caspase-1、IL-1β、IL-18、β-actin 一抗（稀釋比例分別為1∶500、1∶500、1∶500、1∶500、1∶500、1∶500、1∶1 000），孵育過夜。洗膜，37 ℃條件下加入二抗（稀釋比例均為1∶5 000），孵育45 min。使用ECL 發光底物檢測抗體，曝光后掃描。采用凝膠圖象處理系統及Gel-Pro-Analyzer軟件分析條帶灰度值，計算目的蛋白相對表達量。

1.7 統計學方法 采用SPSS23.0 統計軟件。計量資料采用S-W 正態性檢驗，呈正態分布以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗，重復測量數據采用重復測量的方差分析；非正態分布以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

每組各有2 只小鼠在造模過程中死亡，治療組有1只于造模后24 h內心臟破裂死亡。最終每組各有9只小鼠存活，共27只小鼠完成實驗。

2.1 各組小鼠心功能相關指標比較 各組小鼠LVIDd 比較P>0.05。與假手術組比較，治療組和模型組小鼠LVIDs均升高，LVEF、FS均降低，并且模型組LVEF、FS 降低更明顯（P均<0.05）。見表1、OSID碼圖1。

表1 各組小鼠LVIDd、LVIDs、LVEF、FS比較（±s）

表1 各組小鼠LVIDd、LVIDs、LVEF、FS比較（±s）

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

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2.2 各組小鼠心肌組織細胞凋亡率比較 模型組、治療組和假手術組小鼠心肌組織細胞凋亡率分別為37.05% ± 1.24%、24.21% ± 5.65%、19.34% ±1.37%，模型組明顯高于假手術組和治療組（P均<0.05），假手術組和治療組比較無統計學差異（P>0.05）。見OSID碼圖2。

2.3 各組小鼠血清NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18、CRP 水平比較 與假手術組比較，模型 組 和 治 療 組 小 鼠 血 清NLRP3、IL-1β、IL-18、CRP 水平均升高，且模型組升高更明顯（P均<0.05）；與假手術組比較，模型組血清ASC 水平升高，治療組血清ASC 水平降低（P均<0.05）；治療組血清Caspase-1 水平高于假手術組和模型組（P均<0.05），而假手術組和模型組之間血清Caspase-1 水平比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。

表2 各組小鼠血清NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18、CRP水平比較（±s）

表2 各組小鼠血清NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18、CRP水平比較（±s）

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

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2.4 各組小鼠心肌組織NLRP3、ASC、Caspase-1、cleaved Caspase-1、IL-1β、IL-18 表達比較 與假手術組比較，模型組、治療組小鼠心肌組織NLRP3、ASC、cleaved Caspase-1、IL-1β、IL-18 蛋白表達均升高，且模型組升高更明顯（P均<0.05）。見表3、OSID 碼圖3。

表3 各組小鼠心肌組織NLRP3、ASC、Caspase-1、cleaved Caspase-1、IL-1β、IL-18相對表達量比較（±s）

表3 各組小鼠心肌組織NLRP3、ASC、Caspase-1、cleaved Caspase-1、IL-1β、IL-18相對表達量比較（±s）

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

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3 討論

SGLT-2 抑制劑是一種通過促進尿葡萄糖排泄來降低血糖的新型降糖藥，而恩格列凈是一種高選擇性SGLT-2 抑制劑，除了降糖療效顯著，還顯示出良好的心血管效益［7-10］。EMPA-REG OUTCOME 研究結果顯示，在合并高心血管風險的2 型糖尿病患者中，恩格列凈治療組的心血管死亡風險下降38%，心力衰竭住院風險下降35%，全因死亡風險下降32%［11］。隨后研究顯示，另外兩種SGLT-2 抑制劑卡格列凈和達格列凈也具有明顯的心血管獲益［12-13］。研究表明，達格列凈在沒有糖尿病的HF 患者中也具有預防的作用［14］。上述研究提示，SGLT-2 抑制劑可能通過降糖之外的其他途徑來發揮其心血管保護作用。盡管有大量關于SGLT-2 抑制劑的動物實驗和臨床研究，但這些藥物改善心血管功能的機制尚不清楚。

很多動物實驗和臨床研究已經報道了SGLT-2抑制劑對缺血性心臟病患者心功能的改善作用。研究顯示，在缺血前給予達格列凈治療可以改善大鼠缺血再灌注損傷（IR），提高左心室功能；在缺血期間給予達格列凈也被證實有一定的心肌保護作用，但效果不如缺血前用藥［15］。但是，在IR 前4 h 或24 h給予恩格列凈并不會影響梗死面積［16］。在缺血性心臟病模型中，SGLT-2 抑制劑的大多數相關研究是在IR損傷前或造模期間單次給藥，或者在IR損傷后進行4周以上的慢性治療。另一項研究顯示，連續6周恩格列凈治療能夠明顯改善IR 小鼠的心肌梗死情況［16］。臨床上很多患者在AMI 后不能及時進行血運重建，因此有必要在缺血后特別是心肌梗死急性期提供適當的藥物干預，以逆轉心功能以及后續可能出現的心室重塑。本研究結果顯示，對AMI 小鼠連續給予7 d 的恩格列凈可顯著降低EF 和FS，明顯改善心功能，為心肌梗死急性期的藥物治療提供了新的方向。

達格列凈治療可降低IR 大鼠急性期心肌細胞凋亡的數量，提示SGLT-2抑制劑具有抗心肌細胞凋亡的作用［15］。卡格列凈治療可降低雄性大鼠心肌IR 急性期體內凋亡標志物Bax/Bcl-2 水平［15，17］。本研究結果顯示，在AMI小鼠中TUNEL 陽性細胞數量顯著增多，恩格列凈治療7 d 后TUNEL 陽性細胞數量顯著減少；這表明恩格列凈可顯著減少AMI 小鼠的心肌細胞凋亡，在治療AMI 后心臟重塑過程中具有重要作用。

NLRP3 炎癥小體由NLRP3、ASC 和Caspase-1 組成，當NLRP3 受到各種危險信號的刺激時，其pyrin結構域與配體結合，促進NLRP3、ASC 和Caspase-1的前體組裝成活化的炎癥小體，并激活Caspase-1；Caspase-1 必須是活性形式才能發揮促炎作用，并且在蛋白質水平更穩定，Caspase-1 活化后進一步將IL-1β 前體（pro-IL-1β）和IL-18 前體（pro-IL-18）加工成具有活性的IL-1β 和IL-18［18］。IL-1β 和IL-18的激活和分泌可觸發心肌梗死后細胞焦亡過程，即炎癥相關性細胞死亡，從而加重缺血性損傷［19］。在糖尿病小鼠模型中，達格列凈通過抑制NLRP3/ASC/Caspase-1 信號通路激活而抑制其心肌病的發展［20］。然而，目前SGLT-2 抑制劑對心肌梗死后NLRP3/ASC/Caspase-1 信號通路的影響尚無廣泛研究。NLRP3 炎癥小體在心肌梗死后被激活，在嚙齒類動物IR 模型中，NLRP3炎癥小體組分的缺失可以減輕炎癥反應、改善心功能、逆轉心肌重塑。本研究結果顯示，AMI 小鼠血清CRP、NLRP3、ACS、IL-1β 和IL-18 水平顯著升高，心肌組織NLRP3、ASC、cleaved Caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表達顯著升高，經恩格列凈治療后顯著下降；這提示AMI 后心肌的炎癥反應被激活，炎癥指標升高，而恩格列凈在心肌梗死過程中具有抗炎作用。本研究AMI 小鼠心肌組織cleaved Caspase-1蛋白表達明顯升高，而Caspase 1蛋白表達及血清學水平均無明顯變化；分析其原因，NLRP3炎癥小體被激活后，促使Caspase-1前體自裂解成為有活性的Caspase-1，進而將IL-1β 前體誘導為成熟的IL-1β。

綜上所述，恩格列凈灌胃治療可以顯著降低AMI小鼠心肌細胞凋亡，并改善左心室功能，其機制可能與抑制NLRP3/ASC/Caspase-1 信號通路有關，提示恩格列凈可作為預防AMI 后心肌重塑和心功能不全的治療藥物。本研究進一步證實了抗炎治療在AMI 治療中的重要性，但仍需要更多的實驗數據來闡明恩格列凈的具體作用機制，評估恩格列凈治療AMI的長期安全性和有效性。