具核梭桿菌感染與高齡食管鱗癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系

李超偉，張哲源，何珂瑤，張家豪，劉怡文，周福有，3

1 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院胸外科，河南新鄉(xiāng) 453003；2 河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)院分子生物實(shí)驗(yàn)室河南省微生態(tài)與食管癌防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室河南省腫瘤表觀遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3 安陽市腫瘤醫(yī)院胸外科河南省食管癌精準(zhǔn)防治醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

食管癌的發(fā)病率和病死率極高，其病理類型主要包括鱗癌（ESCC）和腺癌（EAC），我國90%以上的食管癌患者是ESCC［1-3］。ESCC 早期臨床癥狀不明顯，確診時(shí)大多已發(fā)展至中晚期，而中晚期ESCC 患者5 年生存率極低［4-6］。ESCC 好發(fā)于60～74 歲的老年人，≥75 歲的高齡患者也占有一定比例，而老年患者多存在生理機(jī)能和器官功能退化，對各種治療方案的反應(yīng)更差［7-8］。因此，尋找針對老年ESCC 患者的個(gè)性化治療方案對于改善其預(yù)后至關(guān)重要。本團(tuán)隊(duì)前期研究已證實(shí)，具核梭桿菌（Fn）的長期定植可重塑腫瘤微環(huán)境、削弱機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而促進(jìn)ESCC 細(xì)胞惡性增殖，顯著縮短患者的生存時(shí)間［9-10］。本研究觀察了Fn 感染與高齡ESCC 患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，以期為高齡ESCC 患者的早期預(yù)警及其預(yù)后改善提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019 年1 月—2020 年1 月安陽市腫瘤醫(yī)院胸外科收治、擬行手術(shù)切除的高齡（≥75 歲）ESCC 患者106 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①擬行治療性ESCC 切除術(shù)，且術(shù)后病理診斷明確為ESCC，未合并其他腫瘤；②術(shù)前未接受放化療和免疫治療；③術(shù)后給予常規(guī)紫杉醇與順鉑聯(lián)合（TP）方案輔助化療，未接受放療或免疫治療；④臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前1 個(gè)月內(nèi)使用過抗生素；②術(shù)后病理診斷為非ESCC，或合并有其他腫瘤；③術(shù)前接受過放化療或免疫治療；④術(shù)后未進(jìn)行TP 方案輔助化療，或接受過放療、免疫治療；⑤術(shù)后發(fā)生嚴(yán)重并發(fā)癥或住院死亡。106 例高齡ESCC 患者中男64例、女42 例，吸煙44 例、飲酒34 例，有ESCC 家族史77 例，臨床癥狀：吞咽哽噎103 例、吞咽疼痛9例、胸骨后不適4 例、腹部不適1 例，分化程度：低分化29 例、中高分化77 例，侵及纖維膜71 例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移63 例，臨床分期：Ⅰ/Ⅱ期46 例、Ⅲ/Ⅳ期60例。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)審核，患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 ESCC 組織Fn 感染檢測 采用Q-PCR 法。取患者術(shù)中切除的腫瘤組織，石蠟包埋。取3～8片10～20μm 厚度的石蠟切片，二甲苯脫蠟30 min，梯度乙醇（體積分?jǐn)?shù)分別為100%、90%、80%及70%）水化各5 min，采用DNA 提取試劑盒提取DNA，具體步驟參照呂小璐［11］的研究。采用Q-PCR 試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，F(xiàn)n 引物及探針序列見表1。反應(yīng)體系：2×AceQ qPCR Probe Master Mix 10 μL，上下游引物（10 μmol/L）1 μL，F(xiàn)n 探針0.5 μL，樣本DNA（50 ng/μL）2.0 μL，ddH2O 6.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，共40 個(gè)循環(huán)，統(tǒng)計(jì)Ct 值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次后取平均值。陽性對照為Fn ATCC 25586 標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA，陰性對照為實(shí)驗(yàn)室已鑒定Fn 陰性的ESCC 組織DNA 樣本。Fn感染判定標(biāo)準(zhǔn)：Ct>35 定義為Fn 陰性；Ct≤35 定義為Fn 陽性［11］。

表1 Fn引物及探針序列

1.3 ESCC 組織Fn 16 S rRNA 表達(dá)檢測 采用RNAscope 技術(shù)。取2 μm 厚度的ESCC 組織石蠟切片，二甲苯脫蠟30 min，梯度乙醇（體積分?jǐn)?shù)分別為100%、90%、80% 及70%）水化各5 min 后，采用RNAscope 靶標(biāo)修復(fù)液修復(fù)15 min。采用雙氧水孵育10 min，RNAscope蛋白酶孵育10 min。加入Fn探針，4 ℃孵育過夜，采用RNAscope 顯色試劑進(jìn)行顯色。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：ESCC組織癌細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中均可見彌散性紅色顆粒，定義為Fn 16 S rRNA 表達(dá)陽性［9-10］；于400 倍光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)癌細(xì)胞內(nèi)的紅色顆粒數(shù)，F(xiàn)n 在每個(gè)細(xì)胞中單獨(dú)的紅色顆粒≥8 個(gè)或有成簇的信號(hào)定義為陽性細(xì)胞，每張切片中陽性細(xì)胞比例≥30%為陽性標(biāo)本。

1.4 隨訪方法 患者術(shù)后隨訪時(shí)間為2 年，記錄生存狀態(tài)，刪失數(shù)據(jù)為隨訪至2年仍存活的患者，未刪失數(shù)據(jù)為由ESCC 導(dǎo)致的死亡患者。生存時(shí)間為患者入院至最后一次隨訪或死亡的時(shí)間。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，ESCC 組織中Fn 感染的RNA?scope與Q-PCR結(jié)果的一致性分析采用Cohen′s Kappa系數(shù)，Kappa值>0.7表示一致性顯著、0.4～0.7表示一致性較好、<0.4 表示一致性較差。采用Kaplan-Meier 法繪制ESCC 組織Fn 陽性及陰性患者的生存曲線，生存時(shí)間分析采用Log-Rank 法。以ESCC 組織中Fn 感染（陽性=1，陰性=0）、性別（男=1，女=0）、吸煙（吸煙=1，不吸煙=0）、飲酒（飲酒=1，不飲酒=0）、家族史（有ESCC 家族史=1，無ESCC 家族史=0）、吞咽哽噎（有=1，無=0）、吞咽疼痛（有=1，無=0）、胸骨后不適（有=1，無=0）、腹部不適（有=1，無=0）、分化程度（低分化=1，中高分化=0）、浸潤深度（侵及纖維膜=1，未侵及纖維膜=0）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（陽性=1，陰性=0）、臨床分期（Ⅲ/Ⅳ期=1，Ⅰ/Ⅱ期=0）為自變量，以隨訪2年時(shí)患者的生存狀態(tài)為因變量，采用單因素COX 回歸分析各臨床因素對患者預(yù)后的影響；選擇單因素分析中與預(yù)后有統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)的變量，并納入混雜因素（性別、吸煙及飲酒），進(jìn)行多因素COX回歸分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ESCC 組織Fn 感染情況檢測結(jié)果 Q-PCR 檢測 結(jié) 果 顯 示：106 例ESCC 患 者 中，F(xiàn)n 陽性65 例（61.32%）、陰性41 例（38.68%）；RNAscope 檢測結(jié)果 顯 示：106 例ESCC 患 者 中，F(xiàn)n 陽 性62 例（58.49%）、陰性44 例（41.51%），見OSID 碼圖1。ESCC 組織RNAscope 與Q-PCR 檢測Fn 感染的結(jié)果具有顯著一致性（Kappa 值為0.941，P<0.05），見表2。本研究采用Q-PCR檢測結(jié)果進(jìn)行后續(xù)研究。

表2 ESCC組織Q-PCR與RNAscope檢測Fn感染的一致性分析結(jié)果［例（%）］

2.2 Fn 陽性與陰性高齡ESCC 患者的臨床病理參數(shù)比較 Fn 陽性高齡ESCC 患者男性、吸煙、飲酒、有ESCC 家族史、有吞咽哽噎癥狀、分化程度為低分化、腫瘤侵及纖維膜、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性、臨床分期為Ⅲ/Ⅳ期的比例均高于Fn 陰性患者（P均<0.05），見表3。

表3 Fn陽性與陰性高齡ESCC患者的臨床病理參數(shù)比較［例（%）］

2.3 Fn 陽性與陰性高齡ESCC 患者的預(yù)后相關(guān)指標(biāo)比較 106例高齡ESCC患者2年隨訪結(jié)束時(shí)生存64 例、死亡42 例（2 年生存率60.38%）；其中Fn 陽性高齡ESCC 患者生存28 例、死亡37 例（2 年生存率43.08%），陰性患者生存36例、死亡5例（2年生存率87.80%），F(xiàn)n陽性高齡ESCC 患者的2年生存率明顯低于Fn 陰性患者（P<0.05）。Fn 陽性高齡ESCC 患者的生存時(shí)間明顯短于Fn陰性患者（P<0.05），見表4及圖1。

圖1 Fn陽性與陰性高齡ESCC患者的2年生存曲線

表4 Fn陽性與陰性高齡ESCC患者的生存時(shí)間比較（月）

2.4 Fn 感染對高齡ESCC 患者預(yù)后的影響 單因素COX 回歸分析結(jié)果顯示，吸煙、飲酒、ESCC 家族史、腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、Fn 感染均與高齡ESCC 患者預(yù)后有關(guān)（P均<0.05），見表5。多因素COX 回歸分析結(jié)果顯示，ESCC 家族史、腫瘤侵及纖維膜、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性、臨床分期Ⅲ/Ⅳ期及Fn 陽性均是影響高齡ESCC 患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P均<0.05），見表6。

表5 影響高齡ESCC患者預(yù)后的單因素COX回歸分析結(jié)果

表6 影響高齡ESCC患者預(yù)后的多因素COX回歸分析結(jié)果

3 討論

ESCC 的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后與年齡密切相關(guān)。研究表明，50 歲以下的ESCC 患者數(shù)量明顯少于50 歲以上的患者數(shù)量［12］。與低齡患者相比，高齡ESCC患者由于各項(xiàng)生理和器官功能退化，機(jī)體免疫微環(huán)境重塑，對放化療及免疫治療的反應(yīng)更差，術(shù)后恢復(fù)能力更弱，生活質(zhì)量更低［13］。因此，尋找高齡ESCC的致病因素及發(fā)病特點(diǎn)，對于其個(gè)性化防治策略的制定及改善患者預(yù)后至關(guān)重要。

ESCC的病因包括吸煙、飲酒、飲食、病原微生物感染、免疫功能紊亂及遺傳易感性等。研究顯示，病原微生物的慢性感染是多種腫瘤形成的始動(dòng)因素［14］。人乳頭瘤病毒、幽門螺桿菌及乙型肝炎病毒分別與宮頸癌、胃癌及肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［15-18］。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，口腔條件致病菌Fn可隨吞咽唾液或血液循環(huán)定植于ESCC 組織中，且Fn 可通過富集免疫微環(huán)境中具有負(fù)性調(diào)節(jié)功能的Treg細(xì)胞，使機(jī)體處于免疫耐受狀態(tài)，協(xié)助腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視［10］；Fn 還可誘導(dǎo)具有殺傷功能的CD8+T 淋巴細(xì)胞表面高表達(dá)抑制性受體KIR2DL1，削弱其殺傷功能，從而抑制機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)［9］；Fn 可誘導(dǎo)ESCC 細(xì)胞中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4 高表達(dá)，從而促進(jìn)ESCC 細(xì)胞攝取葡萄糖，維持癌細(xì)胞能量供應(yīng)，促進(jìn)其惡性增殖［19］；Fn 還可通過誘導(dǎo)ESCC 細(xì)胞中NLRP3 高表達(dá)，引發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng)，協(xié)助腫瘤細(xì)胞化療抵抗［20］。雖然Fn對ESCC的致病機(jī)制有待進(jìn)一步探討，但本團(tuán)隊(duì)前期已證實(shí)Fn 陽性的ESCC患者生存時(shí)間顯著縮短［19-20］。為進(jìn)一步探明Fn對高齡ESCC 患者預(yù)后的影響，本研究選擇≥75 歲的高齡ESCC 患者為研究對象，分析Fn感染在高齡ESCC 患者中的感染特征及其對患者生存時(shí)間的影響，以期探明高齡ESCC患者預(yù)后差的原因。

本研究采用兩種檢測方法（RNAscope 與QPCR）檢測106 例ESCC 患者癌組織中Fn 的感染情況，發(fā)現(xiàn)Fn 陽性率分別為58.49%、61.32%。雖然兩種檢測結(jié)果具有顯著一致性，但由于RNAscope檢測對樣本處理要求嚴(yán)格、敏感度、特異度低，因此本研究后續(xù)分析采用更靈敏的Q-PCR 檢測結(jié)果。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)n 陽性的高齡ESCC 患者多為有吸煙、飲酒史的男性患者，提示由于大多數(shù)男性患者長期吸煙、飲酒，口腔環(huán)境差，感染Fn 的風(fēng)險(xiǎn)增加；Fn感染陽性的高齡ESCC 患者有ESCC 家族史的比例顯著升高，提示由于遺傳易感性等因素，此類患者更易感染Fn；Fn陽性患者出現(xiàn)吞咽哽噎癥狀的比例明顯升高，提示Fn 陽性的高齡ESCC 患者易出現(xiàn)吞咽哽噎癥狀；Fn 陽性患者腫瘤低分化的比例更高，提示惡性程度更高的腫瘤及其微環(huán)境更適于Fn定植；Fn 陽性患者腫瘤浸潤深度增加、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率升高且臨床分期多為Ⅲ/Ⅳ期，提示Fn 長期定植可促進(jìn)癌細(xì)胞的惡性增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移。本研究生存分析結(jié)果顯示，F(xiàn)n 陽性患者的2 年生存率及生存時(shí)間均顯著低于陰性患者，且ESCC 家族史、腫瘤侵及纖維膜、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性、臨床分期Ⅲ/Ⅳ期及Fn感染是影響高齡ESCC 患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示有效清除Fn 可能有助于延長高齡ESCC 患者的生存時(shí)間。

綜上所述，有吸煙、飲酒史及ESCC 家族史的男性高齡ESCC 患者感染Fn 的風(fēng)險(xiǎn)升高，且感染Fn 的高齡ESCC 患者預(yù)后更差。由于ESCC 發(fā)病及進(jìn)展的多樣性和復(fù)雜性，F(xiàn)n 的具體致病機(jī)制有待進(jìn)一步探討，但有效清除Fn 可延長高齡ESCC 患者的生存時(shí)間。本研究為高齡ESCC 早期預(yù)警和防治策略提供了參考依據(jù)。