ROCK信號通路對高糖誘導血管平滑肌細胞炎癥反應的調控作用及其與Nur77表達的關系

郭利艷，劉達，陳利俠，魏梅，劉剛，鄭明奇

河北醫科大學第一醫院心血管內科，石家莊 050000

動脈粥樣硬化（AS）是一種以動脈壁內炎癥和脂質沉積為特征的慢性多因素疾病，典型的AS病灶為粥樣硬化斑塊，斑塊糜爛及斑塊破裂后造成的血栓形成是臨床心血管事件發生的主要原因之一，而不穩定斑塊具有脂質壞死核心較大、大量炎癥細胞浸潤及纖維帽較薄等特點［1-2］。血管平滑肌細胞（VSMC）位于血管中膜，是血管壁的重要組成部分［3］。研究表明，VSMC 可發生表型轉化，轉化為巨噬細胞樣細胞、泡沫細胞、間充質干細胞、成骨樣細胞等多種類型，進而影響斑塊穩定性。VSMC 可通過多種方式參與血管炎癥的級聯反應，既可以產生促炎癥細胞因子促進炎癥細胞向血管壁募集，也可以被其他細胞分泌的炎癥因子所調控，而血管炎癥的級聯放大可破壞AS 斑塊的穩定性，促進斑塊破裂［4］。ROCK 是Rhos 相關絲氨酸/蘇氨酸激酶家族的 一 員，是RhoA 和RhoC 激 活 的 下 游 效 應 物［5］。ROCK 信號通路參與了多種心血管疾病的發病，與AS、高血壓、冠狀動脈痙攣等心血管疾病的發生發展關系密切。法舒地爾是一種ROCK 信號通路抑制劑，主要應用于心血管疾病、神經系統疾病和腫瘤的治療。既往研究重點主要是ROCK 信號通路對VSMC 增殖、遷移能力的影響，而其對VSMC 炎癥反應的研究甚少［6］。孤兒核受體Nur77 被認為是調控AS發生發展的關鍵轉錄因子之一，具有一定的抗炎作用。2020 年1 月—2021 年12 月，本研究觀察了ROCK 信號通路及Nur77 表達對高糖誘導VSMC 炎癥反應的影響?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 主要試劑：法舒地爾、Nur77 激動劑Cy?tosporone B（CsnB）均購自上海MCE公司，青—鏈霉素雙抗溶液、胰蛋白酶、DMEM培養基、胎牛血清均購自美國Gibco公司，逆轉錄、qPCR試劑盒均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；ROCK1抗體、ROCK2抗體、白細胞介素6（IL-6）抗體、山羊抗兔熒光二抗、山羊抗鼠熒光二抗均購自美國Abcam公司，白細胞介素1β（IL-1β）抗體購自南京Bioworld公司，Nur77抗體購自美國Santa Cruze公司，山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗均購自北京Easybio公司，α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）抗體購自美國Cell Signaling 公司，腫瘤壞死因子α（TNF-α）抗體購自南京Affinity公司。引物：Nur77及內參PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。主要儀器：倒置顯微鏡、熒光顯微鏡均購自日本Olympus 公司，細胞培養箱、酶標儀均購自美國Thermo公司，PCR儀購自美國應用生物系統公司。

1.2 大鼠VSMC 的提取、培養及鑒定 采用組織貼塊法。選取體質量為120～150 g 的健康雄性SD大鼠20 只，分離、提取主動脈，剪成0.5～1 mm3的組織塊，均勻平鋪于培養瓶底部，置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中開始原代培養。保持培養皿絕對靜置，約3 d 后細胞開始爬出，約5 d 后細胞開始融合。對VSMC 進行平滑肌特異性蛋白α-SMA 免疫熒光染色，熒光顯微鏡下觀察染色情況。結果顯示：細胞核在Hoechst 染色液復染后呈藍色，95%以上的細胞呈強陽性染色，細胞質內可見大量綠色熒光，即α-SMA，說明分離出的VSMC 純度較高。見OSID 碼圖1。

1.3 細胞分組處理 取原代VSMC，每2～3 d 換一次液，在顯微鏡下觀察細胞形態與數目，當細胞鋪滿瓶底90%左右時，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2的比例進行傳代培養。取3～4 代處于對數生長期的VSMC，待細胞密度達80%時，換用無血清培養基饑餓培養24 h，使細胞處于靜止期。將細胞分為對照組、法舒地爾組、高糖組、高糖+法舒地爾組，分別加入葡萄糖5.5 mmol/L、葡萄糖5.5 mmol/L+法舒地爾50 μmol/L、葡萄糖30 mmol/L、葡萄糖30 mmol/L+法舒地爾50μmol/L，作用12 h。

1.4 細胞ROCK1、ROCK2、IL-1β、IL-6、Nur77 蛋白表達檢測 采用Western blotting 法。提取各組細胞總蛋白，加上樣緩沖液煮沸5 min使蛋白變性。采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，將蛋白轉印至PVDF 膜，5%脫脂奶粉在室溫下封閉2 h。加入ROCK1、ROCK2、IL-1β、IL-6、Nur77 及內參β-actin 一抗（稀釋比例均為1∶1 000），4 ℃孵育過夜。TBST 洗膜3 次，加入相應的二抗（稀釋比例均為1∶2 000），孵育1 h。TBST 洗膜3 次，ECL 化學發光液顯影，Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白與內參β-actin 條帶灰度值的比值計算目的蛋白相對表達量。

1.5 細胞Nur77 mRNA 表達檢測 采用實時熒光定量PCR 法。采用TRIzol 試劑提取各組細胞總RNA，檢測RNA 純度和濃度合格后，按照反轉錄試劑說明書配置反轉錄體系，反轉錄成cDNA。根據qPCR 試劑說明書，配制PCR 反應體系。PCR 反應體系：2×Cham Q Universal SYBR qPCR Master Mix 10.0μL、Primer 1（10μM）0.4μL、Primer 2（10μM）0.4 μL、cDNA 2 μL，加入ddH2O 至20 μL。PCR 反應過程：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，循 環40 次。Nur77 引物序 列：上游 引 物5′-AGAAGGATTGCAGAGCGCACG-3′、下游引物5′-TT?GCTGAACTCAAGGGCCAGG-3′，內參β-actin引物序列：上游引物5′- GCAGGAGTACGATGAGTCCG-3′、下 游 引 物5′-ACGCAGCTCAGTAACAGTCC-3′。采用2－ΔΔCt法計算Nur77 mRNA相對表達量。

1.6 高糖作用下Nur77 過表達VSMC 中IL-1β、IL-6表達檢測 將VSMC 隨機分為Nur77 高表達組和空白組，兩組均加入葡萄糖5.5 mmol/L，Nur77 高表達組同時加入CsnB 10 μg/mL，作用12 h 后參照1.4、1.5的方法檢測Nur77 mRNA 及蛋白表達；兩組均更換培養基，加入葡萄糖30 mmol/L，作用12 h 后檢測Nur77及IL-1β、IL-6蛋白表達。

1.7 統計學方法 采用GraphPad 8.0 統計軟件。計量資料采用S-W 正態性檢驗，呈正態分布以±s表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗，重復測量數據采用重復測量的方差分析；非正態分布以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞ROCK1、ROCK2、IL-1β、IL-6 蛋白表達比較 高糖組細胞ROCK1、IL-1β、IL-6 蛋白相對表達量均高于對照組（P均<0.05）。對照組、高糖+法舒地爾組、法舒地爾組細胞ROCK1、IL-1β、IL-6蛋白相對表達量比較差異均無統計學意義（P均>0.05）。各組細胞ROCK2蛋白相對表達量比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表1、圖1。

表1 各組細胞ROCK1、ROCK2、IL-1β、IL-6蛋白表達比較（±s）

表1 各組細胞ROCK1、ROCK2、IL-1β、IL-6蛋白表達比較（±s）

注：與對照組比較，*P<0.05；與高糖組比較，#P<0.05。

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圖1 各組細胞ROCK1、ROCK2、IL-1β、IL-6、Nur77蛋白表達（Western blotting法）

2.2 各組細胞Nur77 mRNA 及蛋白表達比較 高糖組細胞Nur77 mRNA 及蛋白相對表達量均高于高糖+法舒地爾組、對照組、法舒地爾組（P均<0.05），高糖+法舒地爾組、對照組、法舒地爾組比較差異均無統計學意義（P均>0.05）。見表2。

表2 各組細胞Nur77 mRNA及蛋白表達比較（±s）

表2 各組細胞Nur77 mRNA及蛋白表達比較（±s）

注：與對照組比較，*P<0.05；與高糖組比較，#P<0.05。

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2.3 高糖作用下Nur77 過表達VSMC 中IL-1β、IL-6表達變化 低糖環境下空白組和Nur77 高表達組Nur77 mRNA相對表達量分別為0.27±0.06、0.73±0.05，Nur77 蛋白相對表達量分別為0.23 ± 0.05、0.63±0.07，兩組比較P均<0.01；加入高糖后空白組和Nur77 高表達組Nur77 蛋白相對表達量分別為0.57±0.38、0.82±0.04，IL-1β蛋白相對表達量分別為0.56±0.08、0.17±0.05，IL-6蛋白相對表達量分別為0.72±0.06、0.24±0.06，兩組比較P均<0.01。

3 討論

AS 是一種炎癥性疾病，炎癥反應貫穿AS 發病的整個過程，VSMC 在AS 的形成和進展中發揮著重要作用［7］。VSMC 產生的炎癥因子可促進血管炎癥反應、破壞AS斑塊穩定性，從而促進斑塊破裂，其具體的作用機制包括：①血管炎癥可激活血管內皮細胞，促進黏附分子表達及血管通透性增加，從而募集大量的炎癥細胞及脂質成分，致使AS斑塊脂質核心增大；②血管炎癥亦可抑制斑塊纖維帽平滑肌細胞增殖及膠原纖維合成；③血管炎癥還可誘發血管痙攣，改變斑塊處的力學特性，進而破壞AS 斑塊的穩定性。因此，充分了解VSMC 在AS 過程中的作用對于確定預防和治療AS 的治療靶點至關重要。研究顯示，長期持續性高血糖可致血管、心臟、腎等發生慢性損害，VSMC 在高糖狀態下表型發生改變，炎癥反應增強，因此高糖狀態會加劇AS 的進展［8-10］。本研究結果顯示，高糖作用后VSMC 中的IL-1β、IL-6蛋白表達升高，證明高糖可以引起血管炎癥反應，加劇AS進展。

ROCK 是Rho GTPases 的一種效應蛋白，可磷酸化一系列下游靶標，并在細胞收縮、遷移和肌動蛋白細胞骨架組織等各種細胞功能中發揮關鍵作用［11-13］。ROCK 信號通路作為信號“轉換器”或“分子開關”作用于細胞或其靶蛋白后，可誘發細胞增殖、遷移、黏附和炎癥反應等。目前已經鑒定出兩種ROCK亞型，ROCK1和ROCK2。ROCK1主要存在于非神經組織，如肺、肝臟、脾臟、腎臟、睪丸等組織；ROCK2 主要存在于腦組織，但兩者在心臟和血管平滑肌上均有表達［14］。本研究結果表明，高糖作用后VSMC 中的ROCK 信號通路激活，從而引起VSMC 炎癥反應；加入ROCK 抑制劑法舒地爾可顯著降低高糖作用后VSMC 中的ROCK1 及IL-1β、IL-6 蛋白表達，提示可以減輕炎癥反應；在沒有高糖刺激的情況下，單獨抑制ROCK 信號通路對VSMC 的炎癥反應沒有顯著效應，可能是因為在沒有高糖刺激的環境下ROCK 表達較低。ROCK1 和ROCK2 均可參與高糖介導的VSMC 炎癥反應，但發揮作用的程度可能不一樣，ROCK1 參與高糖介導的VSMC 炎癥反應更顯著，這可能與ROCK1 在非神經元組織中表達較高，而ROCK2優先表達于大腦組織有關。

孤兒核受體是一類尚未發現特異性配體的核受體，可被多種細胞內外刺激因素如炎癥、細胞因子、應激反應、肽類激素等快速誘導［15］。孤兒核受體中的Nur77 目前研究較為廣泛，被認為是調控AS 發生發展的關鍵轉錄因子之一，也是調控炎癥反應的下游 蛋 白 之 一［16］。CsnB 是Nur77 激 動 劑，通 過 與Nur77的配體結合域結合，可特異性刺激Nur77的轉錄活性，而Nur77 在多種心血管疾?。ㄈ缪苤厮堋S、心臟肥大和心臟缺血再灌注損傷）的發病機制中起關鍵作用［17］。在VSMC中，Nur77可被多種刺激誘導，包括細胞因子、生長因子、炎癥因子、氧化低密度脂蛋白和血管損傷［18］。既往體內研究表明，炎癥性腸病患者和結腸炎小鼠結腸組織中Nur77 表達均顯著降低，而Nur77 缺乏會導致小鼠結腸炎病情加?。?9］。研究顯示，Nur77 可通過抑制NF-κB/p65 轉錄活性以抵消炎癥反應，發揮抗炎作用，敲低Nur77表達則表現出相反的作用［20-21］。本研究結果顯示，VSMC 在低糖環境下加入CsnB 可引起Nur77 表達顯著升高，改換高糖后Nur77 表達還是升高的，而IL-1β、IL-6 蛋白表達均下降；提示Nur77 能夠抑制炎癥反應，對炎癥反應具有負反饋調控作用，即Nur77 具有抗炎作用。但在本研究中對照組與法舒地爾組Nur77 mRNA 及蛋白相對表達量比較無統計學差異，可能與對照組及法舒地爾組VSMC 炎癥因子水平較低，均未能誘導Nur77 mRNA 及蛋白表達升高有關。本研究高糖組Nur77 mRNA 及蛋白相對表達量均高于高糖+法舒地爾組，分析原因可能為VSMC在高糖環境中加入ROCK 抑制劑后的炎癥因子被抑制，因此不能刺激Nur77 高表達，或Nur77 表達處于上升期還沒有到達抑制炎癥的節點。

綜上所述，阻斷ROCK 信號通路和上調Nur77表達均可抑制高糖誘導的VSMC 炎癥反應。ROCK信號通路是引發炎癥反應的上游通路，而Nur77 是炎癥反應發生后引起反應的下游蛋白，既往鮮見ROCK信號通路與Nur77表達之間調控關系的研究，本研究提示ROCK 信號通路與Nur77 表達之間可能存在某種調控關系，這正是文章的創新點，但其具體的調控關系尚不清楚，需要進一步研究證實，同時也為以后更進一步研究提供新的方向。本研究證明Nur77 可能是調節AS 斑塊形成的重要核激素受體，為預防和治療AS 的新藥開發提供了新的靶點和研究方向。