基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析丁香酚治療心肌缺血再灌注損傷的作用靶點及相關(guān)通路

韓運祺，石佳琦，朱秋夢，錢新宇，肖云峰，李文妍

1 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，呼和浩特 010110；2 內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院藥學(xué)處

心肌缺血再灌注損傷（MIRI）被認為是現(xiàn)階段導(dǎo)致人類死亡的主要心血管疾病之一，具有發(fā)病迅速、病死率高的特點［1］。在MIRI 的治療中，有許多中成藥、中藥湯劑和中藥注射劑可作為常規(guī)治療的輔助藥物［2］。丁香酚是從丁香或其他含丁香酚芳香油的植物中分離得到的淡黃色稠性油狀液體［3］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，丁香酚具有多種藥理活性，包括解熱鎮(zhèn)痛、抗炎、抗氧化、麻醉、改善學(xué)習(xí)記憶和神經(jīng)保護等作用［4］。丁香酚的心臟保護作用已有報道，但其具體機制尚未可知。馬強等［5］報道指出，丁香酚可以增強心肌細胞H9C2 的超氧化物歧化酶（SOD）活力、減少丙二醛（MDA）產(chǎn)生及乳酸脫氫酶（LDH）釋放，從而明顯升高過氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)后的心肌細胞存活率，減少細胞凋亡。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是采用藥理學(xué)、生物信息學(xué)等方法對藥物與疾病之間的成分、靶點以及信號通路進行分析［6］。2022 年2月—3 月，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析丁香酚治療MIRI的作用靶點和相關(guān)通路，為了解丁香酚治療MIRI的相關(guān)機制提供思路。

1 材料及方法

1.1 丁香酚作用靶點收集 將“Eugenol”輸入中藥系統(tǒng)級藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫TCMSP（https：//old. tcmsp-e.com/tcmsp.php）檢索框，限定詞為“chemical name”，得出Eugenol 的CAS 號并記錄，將所得CAS 號輸入Pubchem（https：//pubchem. Ncbi . nlm. nih. gov）數(shù)據(jù)庫得出SMILE 號。將SMILE 號導(dǎo)入Swiss（Swiss target prediction. ch）數(shù)據(jù)庫得到Eugenol 的作用靶點，刪去重復(fù)值，獲得丁香酚作用靶點，導(dǎo)入Cyto?scape（https：//cytoscape.org/）軟件中繪制丁香酚—靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2 MIRI 相關(guān)靶點收集 以“Myocardial ischemiareperfusion”為關(guān)鍵詞，在OMIM（http：//www.omim.org/）、GeneCards（https：//www. genecards. org/）數(shù)據(jù)庫進行檢索，獲得MIRI相關(guān)靶點，刪去重復(fù)值。

1.3 丁香酚-MIRI 共同靶點篩選 在Venny2.1 在線軟件作圖工具平臺上輸入丁香酚作用靶點與MIRI 相關(guān)靶點，進行交集處理后，以韋恩圖的形式展示丁香酚-MIRI 共同靶點，獲得丁香酚治療MIRI的潛在靶點。將上述所得的丁香酚-MIRI 共同靶點輸入Cytoscape3.7.2 軟件，繪制藥物—靶點—疾病網(wǎng)絡(luò)圖，以便更清晰、直觀地展示藥物與疾病交集的靶點。

1.4 丁香酚治療MIRI 核心靶點的篩選 將丁香酚-MIRI 共同靶點上傳至String10.0（https：//stringdb.org）數(shù)據(jù)庫，設(shè)置蛋白種類為“Homo sapiens”、最低相互作用閾值為0.4，獲取靶點相互作用的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系數(shù)據(jù)；將其導(dǎo)入Cytoscape3.7.2 軟件，繪制蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）圖，以節(jié)點的大小、顏色及深淺變化代表Degree 值的大小；將已經(jīng)構(gòu)建好的PPI 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2 軟件，使用MCODE（Mo?lecular Complex Detection）模塊在龐大的網(wǎng)絡(luò)中根據(jù)邊和節(jié)點的關(guān)系進行聚類分析，尋找核心靶點。

1.5 丁香酚治療MIRI 靶點的功能與通路富集分析 應(yīng) 用Matescape（https：//metascape. org/gp/index.html）基因富集分析在線工具數(shù)據(jù)平臺，對上述所得33 個丁香酚-MIRI 共同靶點進行GO 功能和KEGG 通路富集分析，GO 功能富集分析包括生物學(xué)過程、細胞成分和分子功能。

2 結(jié)果

2.1 丁香酚-MIRI 共同靶點篩選結(jié)果 共得到不重復(fù)的丁香酚作用靶點100個、MIRI相關(guān)靶點1 085個，丁香酚作用靶點網(wǎng)絡(luò)圖見OSID 碼圖1。繪制韋恩圖后得到丁香酚-MIRI 共同靶點33 個，見表1 及OSID碼圖2、3。

表1 丁香酚-MIRI共同靶點篩選結(jié)果

2.2 丁香酚治療MIRI核心靶點的篩選結(jié)果 丁香酚-MIRI 共同靶點的PPI 圖顯示共得到234 條邊，其中Degree 值前6 位的作用靶點為蛋白激酶B-α（Akt1）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、內(nèi)皮一氧化氮合成酶3（NOS3）、甾體激素受體共激活因子（SRC）、血管內(nèi)皮生長因子受體2（VEGFR-2）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK14），每個活性成分平均節(jié)點度7.09，PPI 富集P值為1×10?16，見OSID 碼圖4。基于聚類分析的核心靶點篩選結(jié)果顯示共得到2個基因簇和2 個核心基因，核心基因分別為Akt1、VEGFA，見OSID碼圖5。

2.3 33 個丁香酚-MIRI 共同靶點的GO 功能及KEGG 通路富集分析結(jié)果 GO 生物功能富集分析結(jié)果顯示，丁香酚-MIRI 共同靶點主要涉及的生物學(xué)過程包括蛋白質(zhì)磷酸化的正向調(diào)節(jié)、離子平衡、細胞遷移等，主要涉及的細胞成分包括突觸后膜、膜筏、微膜區(qū)等，主要涉及的分子功能包括蛋白激酶活性、血紅素結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子等，見OSID 碼圖6。丁香酚-MIRI 共同靶點的KEGG 富集通路共有177 條，主要包括晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGE）—糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、Toll 樣受體（TLR）信號通路等，見OSID碼圖7。

3 討論

MIRI 是一種由于心肌組織缺血缺氧一定時間，恢復(fù)其供氧供血后心肌組織呈進行性加重的病理進程［7］。流行病學(xué)研究表明，目前MIRI 的病死率占心肌梗死病死率的41.7%［8］。MIRI的發(fā)生與氧化應(yīng)激反應(yīng)、鈣離子超載、炎癥反應(yīng)、線粒體形態(tài)功能障礙等有關(guān)，但是其具體機制尚不明了［9］。中醫(yī)藥在治療MIRI 方面有著獨特優(yōu)勢，相比單一化合物，中藥制劑具有多組分、多靶標(biāo)、多路徑、交互作用的特點，這也是對其進行機制研究時難度更高的主要原因［10］。本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，通過大數(shù)據(jù)挖掘，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖，從而預(yù)測丁香有效成分丁香酚治療MIRI的靶點及作用機制，為植物藥材與現(xiàn)代化研究相結(jié)合提供了新的思路和策略。

丁香酚是天然藥物，作為揮發(fā)油類物質(zhì)多見于治療缺血再灌注損傷的相關(guān)研究。SUN等［11］研究表明，丁香酚可通過調(diào)節(jié)p-mTOR/mTOR 而減輕腦缺血再灌注損傷。劉啟祥等［12］研究顯示，丁香酚可通過抑制NF-κB表達達到減輕大鼠腎缺血再灌注損傷的作用。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究丁香酚治療MIRI 的潛在作用靶點和相關(guān)通路，結(jié)果顯示Akt1、VEGFA 可能是丁香酚治療MIRI 的核心作用靶點。近來研究表明，蛋白激酶B（PKB，又名Akt）參與了細胞增殖、分化、血管生成、炎癥反應(yīng)等過程［13-14］。Akt 位于PI3K/Akt 途徑的中心，是最重要的PI3K 下游靶標(biāo)，心肌保護作用的部分機制依賴于Akt 蛋白的磷酸化［15］。研究證明，丹酚酸β 能有效降低MIRI大鼠的細胞凋亡指數(shù)，上調(diào)Bcl-2、p-Akt 蛋白表達，下 調(diào)Bax、Caspase-3 表 達，而PI3K/Akt 抑 制 劑LY29004 則具有相反的作用，提示丹酚酸β 通過調(diào)控PI3K/Akt 通路抑制心肌細胞凋亡［16］。已有研究證實，VEGFA 和血管緊張素1（Ang-1）可通過調(diào)節(jié)細胞增殖、抑制細胞凋亡和減少氧自由基釋放，對缺血再灌注損傷后的心臟發(fā)揮保護作用［17］。除上述2個靶點外，MAPK 在PPI 圖中也處于較核心的位置。MAPK 不僅在MIRI 中具有至關(guān)重要的作用，而且還參與了MIRI 的氧化應(yīng)激及細胞凋亡過程［18］。MAPK 激活可加重心肌細胞損傷，降低心功能。因此，下一步實驗可驗證Akt1、VEGFA、MAPK 是否為丁香酚治療MIRI 的作用靶點。本研究KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示，丁香酚可能通過AGE-RAGE、MAPK、TLR等信號通路參與治療MIRI。

綜上所述，丁香酚治療MIRI的核心靶點主要有Akt1、VEGFA，主要涉及AGE-RAGE、MAPK、TLR 等相關(guān)通路；丁香酚可能通過蛋白質(zhì)磷酸化的正向調(diào)節(jié)、離子平衡、細胞遷移等生物過程治療MIRI，并涉及蛋白激酶活性、血紅素結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子等分子功能。系統(tǒng)預(yù)測丁香酚治療MIRI 的作用靶點與相關(guān)通路有利于進一步探索其作用機制，但是本研究不能完全證明預(yù)測結(jié)果的正確性，還需要開展體內(nèi)外實驗進行驗證。