PTPN12低表達參與調控肺癌H1299細胞凋亡的作用及對放療敏感性的影響

張 凱 劉培培 張 松 楊 崢 饒石磊 齊書然 余 杰 王 旸

肺癌在臨床治療中通常采用外科手術、放射療法和化學療法等綜合措施，但各種報道顯示，即使在早期進行根治性手術患者5年生存率也相對不高。隨著腫瘤分子流行病學的學科發展，研究者們發現了多種與肺癌淋巴結轉移、組織侵襲相關的腫瘤標志物。肺癌患者死亡的主要原因是癌細胞的侵襲和轉移，細胞外基質降解，腫瘤細胞的粘附和遷移，血管生成和淋巴浸潤在肺癌轉移中起著重要作用。 在臨床上，肺癌轉移機理的研究得到了高度重視[1-2]。PTPN12作為細胞粘附分子選擇素家族的成員之一，僅在內皮細胞被某些刺激激活時才表達，并且與腫瘤細胞轉移密切相關[3-4]。研究提示，PTPN12參與細胞信號轉導過程，并且在許多良性或惡性腫瘤疾病中可以觀察到血清水平的變化[5-6]。本文將針對PTPN12低表達參與調控肺癌H1299細胞凋亡的作用進行研究。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

研究納入臨床患者為2019年1月至2020年12月我院收治的肺癌患者，樣本量為82例，收集受試對象相關資料以備分析討論。納入標準：經病理學明確診斷，且為首發肺癌的受試對象；具有放化療等綜合治療措施適應證的確診患者；預計生存時間高于6個月；患者能配合研究始終。排除標準：合并冠心病、糖尿病等疾患的受試對象；并發其他惡性腫瘤的受試對象；對于本研究中包含的治療方案不能耐受，或拒絕接受治療的患者；術后并發癥嚴重的患者。本次研究共納入男性45例，女性37例；年齡41～82歲，平均年齡(64.34±10.75)歲；其中包含肺鱗癌患者33例，肺腺癌49例；腫瘤分期情況(TNM):Ⅰ期16例，Ⅱ期30例，Ⅲ期22例，Ⅳ期14例；既往有吸煙史48例。

1.2 方法

1.2.1 PTPN12-mRNA及蛋白表達的測定與分析 通過western blot實驗分析PTPN12-mRNA表達特征；同時對蛋白表達進行測定。

1.2.2 PTPN12基因突變 提取DNA：使用10%中性福爾馬林對標本固定完成進行石蠟包埋，病理切片采用HE染色，出血壞死部位在觀察過程中盡量避開，從石蠟包埋塊中取出直徑為0.5 cm的組織塊，腫瘤組織集中并重新涂抹石蠟，嵌入5 μm厚的連續切片(共6個切片)。 QIAamp DNA FFPE組織試劑盒用于從樣品中提取DNA。研究使用的分光光度計為NanoDrop 1000型，用于確定樣品中DNA的濃度和純度。用紫外分光光度計檢測提取的DNA，以進行濃度檢測和質量評估。在DNA濃度介于1.8至2.0之間后，將DNA濃度稀釋至2.0 ng/μL，并為每批樣品添加陰性和陽性對照，以確保測試質量。

進行PCR檢測及測序分析：本研究中相關試劑盒購自廈門艾德公司。通過聚合酶鏈反應(PCR)測序方法和電泳毛細管(ABI 3130XL)檢測樣品PTPN12基因外顯子18～21中的突變。該檢測試劑盒采用八鏈PCR試管設計，該試管配備了PTPN12突變檢測試劑和相應的質量控制試劑。在檢測過程中，將42.3 μL模板DNA和2.7 μL Taq酶混合，并添加5 μL上述相應的試管混合物以形成PCR反應系統。反應條件：95 ℃ 5 min，1個循環； 95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，15個循環； 93 ℃ 25 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 20 s，31個循環。在延伸期間在60 ℃收集信號。通過瓊脂糖凝膠電泳(western blot)鑒定PCR產物后，通過核酸外切酶和熱敏磷酸酶去除引物和dNTPs，并對純化的PCR產物進行PCR測序，反應條件為：純化的PCR產物(10 ng/μL)1 μL， BigDye(2.5×)8 μL，引物3.2 pmoL/μL，10 μL去離子水，測序引物用NaAc和乙醇純化，然后進行雙向測序。使用的儀器是ABI7500實時熒光定量PCR儀器，并通過相關軟件分析了測序結果。

研究中相關結果判讀：突變Ct值≥陰性臨界值29時，判定陰性，突變Ct值<陽性臨界值26時為強陽性(26～29之間為弱陽性)。western blot法完成擴增產物等蛋白的定性和定量分析：電泳后從玻璃板上剝離凝膠，將其放入沸騰的凝膠盒中，加入25%的乙醇直至乙醇浸透凝膠表面。將膠盒放入微波爐中，在高溫下煮2.5 min，重復此步驟3次；隨后，加入考馬斯亮藍染色液(直到染色液浸入凝膠表面)，然后將其放在室溫下的搖床上緩慢旋轉30 min，直到清晰可見凝膠帶為止；第三步，用ddH2O沖洗染色的凝膠后，加入5%的乙酸和25%的乙醇的混合物，并緩慢搖晃漂白搖床約1 h，直到染色液基本洗脫出來。最后，變色完成后用ddH2O沖洗凝膠，將其放置在凝膠圖像掃描分析儀中，并在使用成像軟件處理后拍攝并保存照片。

1.2.3 血清腫瘤標志水平測定 采用化學發光法檢測外周血血清腫瘤標志物[糖類抗原125(CA125)、癌胚抗原(CEA)、神經元特異性烯醇化酶(NSE)、細胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)、鱗狀上皮細胞癌抗原(SCC-Ag)、腫瘤特異性生長因子(TSGF)]，檢測時嚴格依據試劑盒說明書進行操作。參考區間：CA125 0～25.0 U/mL，CEA 0～5.0 μg/L，NSE 0～15.0 ng/mL，SCC-Ag 0～1.5 μg/L，CYFRA21-1 0～3.3 ng/mL，TSGF 0～64 ng/mL。

1.2.4 放療敏感性分析 采用0 Gy、2 Gy、4 Gy的γ射線照射PTPN12不同表達的腫瘤細胞NCI-H446；通過MTS實驗、集落形成實驗對腫瘤細胞的增殖情況進行測定，分析PTPN12對腫瘤放療敏感性的影響。

1.3 統計學處理

采用描述性統計學指標(均數、標準差、中位數、四分位間距、極差、率、構成比、相對比等)對研究結果中的一般資料進行統計學描述；對服從正態分布的計量資料采用兩獨立樣本t檢驗或單因素方差分析進行組間資料的比較，對不服從正態分布的計量資料采用兩組或多組資料的秩和檢驗，進行組間資料的比較；采用χ2檢驗進行率的比較；依據數據是否服從二元正態分別采用pearson或spearman法進行相關分析；無特殊說明情況下顯著性水平ɑ=0.05，所有P值表示雙側概率。

2 結果

2.1 PTPN12表達對肺癌病情的調控作用分析

PTPN12表達對肺癌病情的調控作用分析結果可見，在組織分化和病理分期更嚴重的患者中PTPN12-mRNA表達更低，且在隨訪生存期更低的患者中也可見表達更低，均有統計學意義，如表1所示。但PTPN12蛋白表達只在不同病理分期患者中檢出差別有統計學意義，且同mRNA表達規律相一致；而在不同組織分化和預后患者間差別尚未見統計學意義，與樣本量等因素限制有關，見表1。

表1 PTPN12表達與肺癌病情預后的關聯分析

研究還對PTPN12基因突變檢測結果進行了進一步分析，NSCLC患者癌組織標本PTPN12基因突變的檢測結果顯示，外顯子19突變21例、外顯子21突變17例，無外顯子19與外顯子21的雙突變。見表2、圖1。

注：1a：19外顯子缺失突變，1b與1c：21外顯子點突變。

表2 PTPN12基因突變特點

與此同時，PTPN12基因突變與PTPN12基因野生型患者血清腫瘤標志物水平比較，結果發現PTPN12基因突變者血清CEA高于PTPN12基因野生型患者，而CA125、CYFRA21-1低于PTPN12基因野生型患者，兩者SCC-Ag、NSE、TSGF水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 PTPN12基因突變與PTPN12基因野生型患者血清腫瘤標志物水平比較

采用PCR法擴增PTPN12-mRNA片段，并采用Western blot檢測受試者血清中PTPN12-mRNA表達特征，結果顯示，PTPN12突變型組織樣本組在592 bp左右位置處可見清晰條帶(group1～group5)，而 PTPN12野生型樣本組(group6)及DNA marker組(group7)基本無條帶，表明PTPN12-mRNA在細胞肺癌患者中發生特異性表達的理論依據成立。詳見圖2。

注：1～5:PTPN12突變型組織樣本；6:PTPN12野生型樣本；7:DNA marker。

2.2 PTPN12表達調控肺癌H1299細胞凋亡及對患者放療敏感性的影響作用

PCR以及Western blot檢測結果提示PTPN12的mRNA水平及其蛋白質表達水平無論高低與否，轉染 shRNA PTPN12進行基因下調的H1299細胞均可見PTPN12的表達下降(P<0.05)，詳見表4和圖3所示。轉染后H1299-shGFP 及H1299-shPTPN12細胞對放療不同劑量照射(0、2、4、6、 8 Gy)敏感性不一，通過建立兩組細胞生存曲線并進行分析，可見H1299-shGFP及H1299-shPTPN12細胞的DO值、Dq值以及 SF2值分別(3.01 Gy、3.42 Gy、0.92及1.83 Gy、2.42 Gy、0.70)差別有統計學意義(P<0.05)；詳見圖4所示。另外進一步以PTPN12表達為二分類自變量，參考其他潛在影響患者放療敏感性的因素(年齡、性別、腫瘤組織分化情況、腫瘤分期情況)，進行多因素回歸分析，也提示PTPN12表達是獨立影響放療敏感性的因素，OR值為3.404(95%CI 1.258～9.254)，P<0.05。

表4 PTPN12基因表達變化對H1299的轉染存活的影響分析

圖3 PTPN12基因表達變化對H1299存活影響PCR結果圖

圖4 PTPN12基因表達對H1299放療敏感性的影響分析

3 討論

腫瘤的侵襲和轉移程度決定了肺癌患者的預后。 腫瘤細胞通過與白細胞的粘附激活相關的腫瘤信號通路，積聚在血管中或穿透血管壁。這個過程涉及許多粘附分子，其功能是幫助腫瘤細胞識別靶器官的血管內皮細胞[7]。PTPN12是表達于內皮細胞和腫瘤血管內皮細胞，激活相關的信號通路分泌粘附分子選擇素，研究證實，其表達在癌周組織的血管內皮細胞中呈現高表達，與腫瘤的侵襲和轉移存在關聯性[8]。PTPN12可直接介導腫瘤細胞與血管內皮的黏附，同時與腫瘤細胞表達的選擇素配體具有相互識別的功能，可增加腫瘤轉移的概率[9]。有研究提示，血清PTPN12濃度的升高可能會增強血管內皮對腫瘤細胞的攝取能力，也有可能作為促進腫瘤轉移的信號分子[10]。PTPN12作為免疫球蛋白黏附因子之一，在多種細胞膜表面均可表達，發揮著抗原識別、呈遞以及淋巴細胞殺傷等功用[11]。既往研究結果證實[12]，惡性腫瘤患者體內腫瘤細胞會過度表達PTPN12，一方面增加已轉移腫瘤細胞的黏附性，另一方面促進特異性蛋白酶水解，增加血清中PTPN12濃度，使腫瘤細胞逃脫細胞免疫監視。

本研究患者癌組織標本檢出PTPN12基因突變，發生率為37.50%，與其他相關研究報道的NSCLC患者PTPN12突變率38.8%的結果相近，結果表明，NSCLC患者的PTPN12突變主要集中在外顯子19缺失和外顯子21點突變，外顯子19突變主要是746至750位密碼子缺失突變，產生相應的氨基酸序列[13]。PTPN12是跨膜糖蛋白。在NSCLC中，PTPN12高度表達，并且PTPN12基因突變后DNA或基因中的單個堿基對變化可以增加PTPN12對三磷酸腺苷(ATP)的親和力，并增加NSCLC患者的酪氨酸激酶活性。靶向酪氨酸臨床實踐中使用的激酶抑制劑如吉非替尼和厄洛替尼優先結合突變蛋白PTPN12的ATP來取代ATP，然后抑制磷酸化和下游信號通路的活化，因此其功效與PTPN12突變[14]。目前多數NSCLC患者在初診時已達晚期，無法獲得足夠的腫瘤組織進行PTPN12基因突變檢測，分析PTPN12突變患者臨床特征有積極意義[15]。外周血循環腫瘤DNA為一種主要來自腫瘤組織，因腫瘤細胞壞死脫落，能較好體現腫瘤遺傳基因的特征，因而監測腫瘤標志物水平可能對推斷PTPN12突變有益。

總之，PTPN12低表達同肺癌患者的放射敏感性存在關聯，PTPN12下調可以有效增加H1299細胞的放射敏感性，可以考慮作為提示患者的放射敏感性靶點，并為靶向治療聯合放療提供更多依據。