Oct4B1基因沉默通過調控AKT/GSK-3β/β-catenin通路對膀胱癌T24細胞上皮間質轉化的影響及機制研究

甄洪濤 王朝亮

膀胱癌是臨床常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，在男性中發(fā)病率居于第6位，女性中居于第16位，近年來發(fā)病率和致死率均呈上升趨勢[1]。目前，膀胱癌以手術切除結合化療等綜合治療為主，但仍有較高的復發(fā)率，給患者生命健康造成嚴重威脅[2]。研究表明，上皮間質轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)是上皮細胞來源的惡性腫瘤獲得侵襲和遷移能力的主要原因之一，與病灶遠端轉移、復發(fā)及化療耐藥等不良預后關系密切[3]。目前關于膀胱癌細胞EMT調控機制尚未完全闡明，尋找針對性干預靶點，對改善疾病預后有重要意義。八聚體結合轉錄因子4(octamer blinding transcription fator 4，Oct4)B1是胚胎干細胞干性轉錄因子Oct4的主要亞型。近年來研究表明，Oct4在膀胱癌組織中呈高表達狀態(tài)，且表達程度與膀胱癌轉移及遠期預后關系密切[4]。體外實驗證實，Oct4B1基因過表達可增強結直腸癌細胞的遷移和侵襲能力[5]。目前，關于Oct4B1基因對膀胱癌細胞EMT過程的影響研究尚少，本研究應用RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術沉默膀胱癌T24細胞Oct4B1基因，觀察對細胞EMT過程的影響，并初步探討其影響機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人膀胱癌T24細胞株，購自上海中科院細胞庫，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2。

1.1.2 主要試劑和儀器 含綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的Oct4B1-短發(fā)夾RNA(shRNA)質粒干擾載體、陰性對照質粒(上海吉瑪制藥技術有限公司)，蛋白激酶B激動劑(胰島素樣生長因子IGF-I，美國Abcam公司)，LipofactamineTM2000試劑盒、RNA提取試劑盒(美國Invitrogen公司)，逆轉錄試劑盒(日本Takara公司)，全蛋白提取試劑盒(上海藍基生物科技有限公司)，Transwell小室(美國Corning Incorporated公司)，兔抗人Oct4B1多抗、兔抗人E-cadherin、Vimentin、N-cadherin單抗、兔抗人p-AKT、p-GSK-3β、β-catenin單抗(美國Abcam公司)，辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG抗體(北京中山金橋生物技術有限公司)。Varioskan LUX多功能酶標儀(美國Thermo Fisher公司)，7300實時熒光定量PCR儀(美國ABI)，CheniDoc XRS化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)(美國Bio-rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞轉染及分組 取對數(shù)期T24細胞，調整細胞密度為1×105/ml，重新接種于6孔板，細胞再次融合達60%時，按照LipofactamineTM2000試劑盒說明書操作，將Oct4B1-shRNA質粒干擾載體、陰性對照質粒轉入T24細胞中，分別設為shRNA組、shRNA-NC組，每組5個復孔，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)5 h后，更換培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的RPMI1640，繼續(xù)培養(yǎng)至24 h，于熒光顯微鏡下觀察轉染效率。

另取轉染至8 h的shRNA組、shRNA-NC組細胞，分別用AKT激動劑IGF-I(100 ng/ml)處理12 h，分別設為shRNA+AKT激動劑組、shRNA-NC+AKT激動劑組，每組5個復孔，然后更換常規(guī)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至24 h進行后續(xù)實驗。

1.2.2 Oct4B1 mRNA表達檢測 收集轉染至24 h的shRNA組、shRNA-NC組細胞及shRNA+AKT激動劑組、shRNA-NC+AKT激動劑組細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，按照RNA提取試劑盒說明說提取總RNA，并用逆轉錄試劑盒合成cDNA。設計PCR擴增引物序列：Oct4B1：F:5′-CTGATGCTGGAACGTTAGCTG-3′,R:5′-AGTAGCTGTGATGCGTGATGC-3′;β-actin：F:5′-TAGCTGATGCTGTGAAACCT-3′;R:5′-CTATGCTGTAGTGCTGATCG-3′。按照說明說設定反應體系，反應條件為：94 ℃預變性5 min；40個循環(huán)(94 ℃變性20 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s)；72 ℃延伸5 min。以β-actin為內參對照，2-△△CT為Oct4B1的相對表達強度。

1.2.3 侵襲能力檢測 采用Transwell實驗檢測shRNA組、shRNA-NC組、shRNA+AKT激動劑組、shRNA-NC+AKT激動劑組細胞侵襲能力。Transwell小室濾膜由RPMI 1640培養(yǎng)基1∶6稀釋的Matrigel包被，將小室放入24孔板，上層小室加入密度為2.0×105/ml各組細胞懸液200 μl，下層小室加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。常規(guī)培養(yǎng)24 h，用無菌棉簽擦去上層小室細胞，以0.1%結晶紫染色0.5 h，顯微鏡下計數(shù)5個隨機視野中的穿膜細胞數(shù)，取平均值。

1.2.4 遷移能力檢測 采用劃痕實驗檢測shRNA組、shRNA-NC組、shRNA+AKT激動劑組、shRNA-NC+AKT激動劑組細胞遷移能力。取各組細胞以2×104/ml重新接種至24孔板，完全融合為單層細胞后，用20 μl無菌槍頭劃直線，PBS輕柔沖洗劃痕邊緣，記為0 h，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，各組細胞于0 h和48 h分別取3個不同視野進行拍照，Image分析計算細胞遷移率(%)=(0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.2.5 上皮間質標記物E-cadherin、Vimentin、N-cadherin及AKT/GSK-3β/β-catenin通路蛋白表達檢測 收集轉染至24 h的shRNA組、shRNA-NC組細胞及shRNA+AKT激動劑組、shRNA-NC+AKT激動劑組細胞，PBC洗滌后轉至離心管，按照全蛋白提取試劑盒說明書提取總蛋白，并進行BCA蛋白定量。取40 μg待測蛋白進行SDS聚丙烯酰氨凝膠電泳恒壓分離，濕法轉移至聚偏二氟乙烯膜，加入5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，然后加入一抗稀釋液(E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、β-catenin均為1∶1 000，p-AKT、p-GSK-3β為1∶2 000)，4 ℃孵育過夜，加入HRP標記的山羊抗兔IgG二抗稀釋液(1∶10 000)，常溫孵育2 h，以目的蛋白與內參對照β-actin灰度值比值表示蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 轉染效率觀察

瞬時轉染48 h后，于光學顯微鏡和倒置熒光顯微鏡下觀察并計算shRNA組和shRNA-NC組轉染效率均>80%，可用于后續(xù)實驗。

2.2 各組Oct4B1 mRNA相對表達量比較

RT-qPCR結果顯示，shRNA組、shRNA+AKT激動劑組、shRNA-NC組、shRNA-NC+AKT激動劑組Oct4B1 mRNA相對表達量組間比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。與shRNA組比較，shRNA+AKT激動劑組、shRNA-NC組、shRNA-NC+AKT激動劑組Oct4B1 mRNA相對表達量均較高(P<0.05)；與shRNA+AKT激動劑組比較，shRNA-NC組、shRNA-NC+AKT激動劑組Oct4B1 mRNA相對表達量較高(P<0.05)，shRNA-NC+AKT激動劑組高于shRNA-NC組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組Oct4B1 mRNA相對表達量比較

2.3 各組細胞侵襲能力比較

Transwell結果顯示，shRNA組、shRNA+AKT激動劑組、shRNA-NC組、shRNA-NC+AKT激動劑組穿膜細胞數(shù)分別為(21.20±3.41)個/視野、(46.80±5.73)個/視野、(95.40±10.36)個/視野、(126.60±11.48)個/視野，組間比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=158.530，P<0.001)。與shRNA組比較，shRNA+AKT激動劑組、shRNA-NC組、shRNA-NC+AKT激動劑組穿膜細胞數(shù)均較多，差異有統(tǒng)計學意義(t=8.585、15.212、19.680，均P<0.001)；與shRNA+AKT激動劑組比較，shRNA-NC組、shRNA-NC+AKT激動劑組穿膜細胞數(shù)均較多(t=9.179、13.907，均P<0.001)，且shRNA-NC+AKT激動劑組多于shRNA-NC組，差異有統(tǒng)計學意義(t=4.02，P=0.002)，見圖1。

注：a為P<0.05，與shRNA組比較；b為P<0.05，與shRNA + AKT激動劑組比較；c為P<0.05，與shRNA-NC組比較。

2.4 各組細胞遷移能力比較

劃痕實驗結果顯示，shRNA組、shRNA+AKT激動劑組、shRNA-NC組、shRNA-NC+AKT激動劑組細胞48 h遷移率分別為(25.41±4.40)%、(33.88±5.87)%、(65.15±6.50)%、(86.64±9.38)%，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(F=87.144，P<0.001)。與shRNA組比較，shRNA+AKT激動劑組、shRNA-NC組、shRNA-NC+AKT激動劑組細胞48 h遷移率均較高，差異有統(tǒng)計學意義(t=4.211、10.622、13.215，P均<0.05)；與shRNA+AKT激動劑組比較，shRNA-NC組、shRNA-NC+AKT激動劑組細胞48 h遷移率較高(t=7.984、11.321，P均<0.001)，且shRNA-NC+AKT激動劑組高于shRNA-NC組，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.582，P=0.033)。見圖2。

注：a為P<0.05，與shRNA組比較；b為P<0.05，與shRNA + AKT激動劑組比較；c為P<0.05，與shRNA-NC組比較。

2.5 各組上皮間質標記物E-cadherin、Vimentin、N-cadherin蛋白相對表達量比較

E-cadherin、Vimentin、N-cadherin蛋白相對表達量組間比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與shRNA組比較，shRNA+AKT激動劑組、shRNA-NC組、shRNA-NC+AKT激動劑組E-cadherin蛋白相對表達量升高，Vimentin、N-cadherin蛋白相對表達量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與shRNA+AKT激動劑組比較，shRNA-NC組、shRNA-NC+AKT激動劑組E-cadherin蛋白相對表達量升高，Vimentin、N-cadherin蛋白相對表達量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；shRNA-NC+AKT激動劑組E-cadherin蛋白相對表達量高于shRNA-NC組，Vimentin、N-cadherin蛋白相對表達量低于shRNA-NC組(P<0.05)。見圖3A，3B。

注：a為P<0.05，與shRNA組比較；b為P<0.05，與shRNA + AKT激動劑組比較；c為P<0.05，與shRNA-NC組比較。

2.6 各組AKT/GSK-3β/β-catenin信號通路蛋白表達比較

p-AKT、p-GSK-3β、β-catenin蛋白相對表達量組間比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與shRNA組比較，shRNA+AKT激動劑組、shRNA-NC組、shRNA-NC+AKT激動劑組p-AKT、p-GSK-3β、β-catenin蛋白相對表達量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與shRNA+AKT激動劑組比較，shRNA-NC組、shRNA-NC+AKT激動劑組p-AKT、p-GSK-3β、β-catenin蛋白相對表達量降低，且shRNA-NC+AKT激動劑組低于shRNA-NC組(P<0.05)。見圖4A，4B。

注：a為P<0.05，與shRNA組比較；b為P<0.05，與shRNA + AKT激動劑組比較；c為P<0.05，與shRNA-NC組比較。

3 討論

膀胱癌是一種直接威脅患者生命的疾病，目前，膀胱癌早期行手術切除聯(lián)合術后藥物灌注治療效果較為理想，但仍面臨病灶復發(fā)和轉移的風險[6-7]。臨床調查顯示，膀胱淺表性癌經尿道切除術后仍有10%～60%的患者在12個月內復發(fā)，最終進展為肌層浸潤性癌，預后生存期縮短，分析可能與膀胱癌EMT密切相關[8-10]。EMT是參與腫瘤侵襲和遷移的關鍵步驟，是指上皮細胞在外界誘因下向間質細胞轉化的過程，該過程中細胞失去極性及細胞間黏附能力，同時獲得運動特性，使癌細胞向遠端轉移能力及抗凋亡能力增強，從而增加治療失敗的風險[11-12]。因此，尋找抑制膀胱癌細胞EMT過程的針對性靶點，對膀胱癌的治療有重要意義。

Oct4主要有3個亞型，Oct4A、Oct4B及Oct4B1，研究顯示，Oct4B1在調節(jié)胚胎干細胞干性方面能力較其他亞型強，進一步發(fā)現(xiàn)，Oct4B1在包括膀胱癌在內的多種惡性腫瘤細胞中呈高表達狀態(tài)，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[13-15]。Mirzaei等[16]研究認為，Oct4B1具有抗凋亡特性，有助于癌細胞逃避凋亡機制，可能通過調控抗凋亡基因的表達發(fā)揮作用。Zhou等[17]通過檢測結直腸癌細胞中Oct4B1基因表達變化與EMT的關系，發(fā)現(xiàn)Oct4B1基因可能通過促進癌細胞EMT過程促進細胞自我更新，進而促進腫瘤復發(fā)、轉移過程。上述研究均說明，高表達的Oct4B1基因有助于促進癌細胞發(fā)生EMT，增強細胞侵襲和遷移能力。本研究采用RNAi技術成功敲低膀胱癌細胞中Oct4B1基因，應用Transwell實驗和劃痕實驗檢測發(fā)現(xiàn)，shRNA組穿膜細胞數(shù)少于shRNA-NC組，48 h遷移率及E-cadherin蛋白相對表達量均低于shRNA-NC組，Vimentin、N-cadherin蛋白相對表達量高于shRNA-NC組，提示沉默Oct4B1基因可抑制T24細胞侵襲和遷移能力，抑制細胞EMT過程。

此外，本研究在RNAi沉默Oct4B1基因表達的基礎上，應用AKT激動劑進行干預，結果顯示shRNA-NC+AKT激動劑組及shRNA+AKT激動劑組Oct4B1 mRNA相對表達量、穿膜細胞數(shù)、48 h遷移率及E-cadherin蛋白表達均較shRNA-NC組、shRNA組升高，而shRNA+AKT激動劑組低于shRNA-NC+AKT激動劑組；Vimentin、N-cadherin及p-AKT、p-GSK-3β、β-catenin蛋白表達與上述結果相反，提示AKT信號通路激活有助于促進膀胱癌細胞EMT過程，增強其侵襲和轉移能力；而靶向沉默Oct4B1可抑制AKT激動劑誘導的EMT過程，降低其侵襲和轉移能力，因此，沉默Oct4B1基因可能通過調控AKT/GSK-3β/β-catenin信號通路抑制癌細胞EMT過程。AKT/GSK-3β/β-catenin是誘發(fā)EMT的重要信號通路[18]。AKT磷酸化激活后，引起下游GSK-3β絲氨酸9(Ser9)磷酸化，從而失去與β-catenin結合能力，細胞內游離β-catenin增多進而轉入細胞核，該信號通路被活化[19-20]。β-catenin可與E-cadherin形成復合體，以維持上皮細胞形態(tài)及細胞間黏附作用，β-catenin活化后復合體穩(wěn)定性降低，導致細胞間連接松散，有利于細胞侵襲和轉移[21]。

綜上所述，沉默Oct4B1基因可抑制膀胱癌T24細胞EMT過程，抑制癌細胞侵襲和轉移能力，沉默Oct4B1基因還能抑制AKT/GSK-3β/β-catenin信號通路誘導的EMT轉化作用，為臨床抑制膀胱癌的復發(fā)和轉移提供了參考靶點。