4 種薯蕷屬植物GBSS 基因的電子克隆與生物信息學分析

陳知龍 ,鄭佳豪 ,吳坤龍 ,張壹

(1.文成縣現代農業與康養產業研究院,浙江 文成 325300;2.文成縣科學技術局,浙江 文成 325300)

薯蕷屬 (Dioscorea) 是被子植物門單子葉植物綱薯蕷目薯蕷科下的一個屬,目前該屬已知植物有600 種以上,多為纏繞藤本,有地下塊狀或根狀塊莖是該屬的主要特征[1]。薯蕷屬植物中許多種類具有重要的經濟價值,如溫帶地區普遍栽種的薯蕷(D.opposita),熱帶和亞熱帶地區廣泛栽種的參薯(D.alata)、甜薯 (D.esculenta) 可以供食用和藥用;盾葉薯蕷 (D.zingibernsis)、穿龍薯蕷(D.nipponica)、黃山藥 (D.panthaica) 等植物的根狀莖中含有薯蕷皂苷元,是合成避孕藥及生產甾體激素類藥物的重要原料;薯莨 (D.cirrhosa)的塊莖富含縮合性鞣質和酚類化合物,常用于止血、治療潰瘍、抗菌消炎,也可用于制革等。

淀粉是薯蕷屬植物塊莖的重要組成成分,山藥塊莖中的淀粉可占干物質的50%～80%[2]。淀粉有直鏈淀粉和支鏈淀粉兩種形態,在淀粉合成過程中,顆粒結合淀粉合成酶 (granule-bound starch synthase,GBSS) 是控制直鏈淀粉合成的關鍵蛋白質,負責催化生成線性多聚葡萄糖分子[3]。該蛋白由GBSS基因來編碼,該基因也稱糯性基因(Waxy),或蠟質基因。GBSS基因廣泛存在于大麥、小麥、水稻、玉米、番茄、馬鈴薯等作物中,且已被克隆。研究[4]已證明Waxy基因突變導致胚乳中直鏈淀粉和支鏈淀粉含量及比例發生變化,是禾谷類作物糯性形成的根本原因。對于薯蕷屬植物GBSS基因的研究還鮮有報道,僅吳志剛等[5]克隆了參薯種糯性栽培品系-文成糯米山藥的GBSS基因序列,并進行了初步的基因結構特征及系統進化分析。本研究主要通過生物信息學分析,比較分析參薯、幾內亞白山藥、灌叢薯蕷和盾葉薯蕷4 種薯蕷屬植物GBSS基因結構,蛋白質結構及系統發育特點。研究結果將為進一步闡述薯蕷屬植物GBSS基因及其編碼蛋白調控淀粉合成的分子機制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 電子克隆

以文成糯米山藥GBSS基因序列為探針,BLAST 檢索美國國立生物技術信息中心 (National center for biotechnology information,NCBI,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 中的參薯[D.alata(taxid:55 571)]、幾內亞白山藥[D.rotundata(taxid:55 577)]、灌叢薯蕷[D.dumetorum(taxid:167 584)]、盾葉薯蕷[D.zingibernsis(axid:325984)] 基因組數據庫,同源比對獲得4 種薯蕷屬植物GBSS基因同源序列。

1.2 基因結構與GBSS 蛋白結構分析

以NCBI 數據庫中已注釋的玉米、番茄、馬鈴薯等植物GBSS基因結構為參考,使用同源比對方法分析5 種薯蕷屬植物的GBSS基因結構。利用mVISTA (http://genome.lbl.gov/vista/index.shtml)程序比較分析5 種薯蕷屬植物GBSS基因組序列同源 性。利用 Interpro 數據庫 (http://www.ebi.ac.uk/interpro/) 對GBSS 蛋白進行蛋白質家族和結構功能域分析。

1.3 GBSS 蛋白系統進化分析

從 NCBI 數據庫檢索獲取小麥 (Triticum aestivum,AAL05405)、大麥 (Hordeumvulgare,AAM74048)、節節麥 (Aegilopstauschii,XP _020188467)、水稻 (Oryzasativa,XP_015644489)、小米 (Setariaitalica,NP_001267750)、玉米 (Zea mays,NP _001358937)、高粱 (Sorghumbicolor,XP_002436418)、鐵皮石斛 (Dendrobiumcatenatum,XP _ 028549213)、油棕 (Elaeisguineensis,XP _010940833)、芭蕉(Musaacuminata,XP_009415991)、茶樹 (Camelliasinensis,XP_028108084)、擬南芥(Arabidopsisthaliana,NP _ 174566)、番茄(Solanumlycopersicum,NP _001311458)、馬鈴薯(Solanumtuberosum,NP _ 001274918)、煙草(Nicotianatabacum,NP _ 001311577)、辣椒(Capsicumannuum,XP _ 016564900)、牽?；?Ipomoeatriloba,XP _ 031124794)、羽扇豆(Lupinusangustifolius,XP _019431273)、百脈根(Lotusjaponicus,ACB30384)、蘋果 (Malus domestica,NP_001280924)、油桃 (Prunuspersica,XP_007211283) 和木薯 (Manihotesculenta,XP_021603997) 22 種被子植物的GBSS 蛋白序列。利用ClustalX 2.0 軟件進行蛋白質的多重序列比對,MEGA7 軟件鄰接法構建系統發育樹,并對生成的系統發育樹進行 Bootstrap 校正,循環次數為1 000。

2 結果與分析

2.1 GBSS 基因結構分析

以文成糯米山藥GBSS基因序列為探針,通過同源比對方法獲得參薯、幾內亞白山藥、灌叢薯蕷和盾葉薯蕷GBSS基因的基因組核苷酸序列。參照玉米、番茄、馬鈴薯等已詳細注釋的GBSS基因結構,同源比對分析獲得5 種薯蕷屬植物的GBSS基因結構 (表1)。從表中我們可以看出5 種薯蕷屬植物的GBSS基因結構高度相似,都包含13 個可編碼蛋白質的外顯子和12 個內含子,其中第2～12外顯子的大小在所列物種間高度保守。

表1 薯蕷屬植物GBSS 基因結構分析

以文成糯米山藥GBSS基因組核苷酸序列為參照,比較分析參薯、幾內亞白山藥、灌叢薯蕷和盾葉薯蕷與文成糯米山藥GBSS基因組核苷酸序列的同源性差異 (圖1)。從圖中可以發現,不管是外顯子序列還是內含子序列,文成糯米山藥的GBSS基因序列均與參薯高度同源,這也一定程度說明了文成糯米山藥是參薯種的一個地方栽培品系。盾葉薯蕷的GBSS基因序列與文成糯米山藥保守性稍差,但其外顯子序列的保守性明顯高于內含子。

圖1 薯蕷屬植物GBSS 基因組序列同源性比較分析

2.2 GBSS 蛋白結構分析

參薯、幾內亞白山藥、灌叢薯蕷和盾葉薯蕷GBSS基因的編碼區核苷酸長度依次為1 845、1 842、1 863 和1 839 bp,分別編 碼614、613、620 和612 個氨基酸。4 種薯蕷屬植物GBSS基因的編碼區核苷酸序列與文成糯米山藥的同源性分別為99.3%、97.4%、90.5% 和85.4%,其 編碼的GBSS 蛋白氨基酸序列與文成糯米山藥的同源性分別為98.7%、95.3%、86.3%和81.9%。

GBSS 蛋白屬于淀粉合成酶類蛋白質,除N 端含有一段70 多個氨基酸組成的質體轉運肽外,還包含一個淀粉合成酶催化結構域和一個糖基轉移酶結構域 (圖2)。選取玉米、小米為單子葉代表植物,擬南芥、馬鈴薯為雙子葉代表植物,與5 種薯蕷屬植物GBSS 蛋白進行氨基酸序列同源性比對分析。從圖3 中可以看出,GBSS 蛋白N 端質體轉運肽的保守性較差,但淀粉合成酶催化結構域和糖基轉移酶結構域高度保守,這說明GBSS基因的淀粉合成功能在植物進化過程中高度保守。

圖2 GBSS 蛋白結構域分析

圖3 GBSS 蛋白氨基酸序列分析

2.3 GBSS 蛋白系統進化分析

為了分析不同薯蕷屬植物的GBSS 蛋白之間,以及與其他植物GBSS 蛋白間的進化關系,我們選取5 種薯蕷屬植物以及玉米、小米、擬南芥、馬鈴薯等22 種其他植物的GBSS 蛋白進行同源比對,構建系統進化樹 (圖4)。從進化角度上看,不同植物的GBSS 蛋白在進化過程中可分為單子葉植物和雙子葉植物兩個分支。文成糯米山藥GBSS 蛋白在所列薯蕷屬植物中與參薯GBSS 蛋白的親緣關系最近,與盾葉薯蕷GBSS 蛋白親緣關系最遠。薯蕷屬植物GBSS 蛋白與屬于天門冬目植物的鐵皮石斛GBSS 蛋白的進化距離較近,與油棕目、姜目、禾本目植物的GBSS 蛋白都屬于單子葉植物進化分支。

圖4 多種植物GBSS 蛋白的系統進化分析

3 討論

淀粉是高等植物光合產物主要的儲存形式,可分為直鏈淀粉和支鏈淀粉。直鏈淀粉和支鏈淀粉的相對含量可以影響淀粉的口感、黏性、糊化性以及回生性等特性[6]。植物中有多種酶參與淀粉的合成,其中顆粒結合淀粉合成酶 (GBSS) 被認為在直鏈淀粉的延長中扮演著重要角色[3],它催化形成α-1,4-糖苷鍵,將葡萄糖單元連接在α-1,4-葡聚糖的非還原端,延長α-1,4-葡聚糖鏈。

GBSS 蛋白不能正常表達或活性下降是禾谷類作物糯性形成的根本原因。研究已證明,糯稻主要是由GBSSI基因第1 內含子5′端G/T 突變和第2外顯子23 bp 堿基片段插入,引起前體mRNA 不能正常剪切,導致GBSSI表達量減少所形成的[7]。糯玉米的兩種缺失突變體Wx-D7 和Wx-D10 分別是由于GBSSI基因第7 外顯子和第10 外顯子內堿基缺失造成GBSSI 蛋白功能喪失形成的[8-9]。糯性大麥GBSSI基因啟動子區397 bp 堿基缺失則造成了基因啟動子活性比非糯性大麥弱[10]。控制小麥GBSS 蛋白表達的Wx-A1、Wx-B1、Wx-D1 3 個等位基因發生突變都會影響小麥的糯性,其中缺少3 個Wx 亞基就會得到糯小麥[11]。

利用現代生物技術突變GBSS基因或降低GBSS 蛋白表達也可以使作物獲得糯性特點。利用RNA 沉默策略轉化小麥,降低GBSS 蛋白表達可以顯著下降小麥籽粒胚乳中直鏈淀粉含量[12]。利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術對水稻Waxy基因的外顯子區核苷酸序列實現定點突變,可以將直鏈淀粉含量從親本的15.5%降到2.0%～2.6%,接近或達到糯稻水平[13]。馬鈴薯GBSS4 個等位基因經CRISPR/Cas9 基因編輯均產生突變的突變體則完全缺少了直鏈淀粉的合成[14]。淀粉也是薯蕷屬植物地下塊莖的重要組成成分,因此,深入解析薯蕷屬植物GBSS基因的結構和蛋白結構特點,可為今后調控薯蕷屬植物直鏈和支鏈淀粉合成,以滿足食品、醫藥、工業等行業對不同性質淀粉的需要提供科學依據。