雙孢蘑菇栽培基質中線蟲分離方法評價

賈培松，賈文捷，羅 影，努爾孜亞·亞力買買提，王藝華，溫切木·阿布列孜，魏 鵬

(1.新疆農業科學院植物保護研究所/農業部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點實驗室，烏魯木齊 830091；2.哈巴河縣自然資源局，新疆哈巴河 836700；3.阿勒泰市菜籃子工程辦公室，新疆阿勒泰 836500)

0 引 言

【研究意義】雙孢蘑菇(Agaricusbisporus)是栽培區域最廣、總產量最多的一類栽培菇種[1-2]，也是新疆栽培的主要菇種之一。食用菌栽培中每年因病蟲害帶來產量上的損失約30%，而其中由線蟲造成的損失約60%[3-5]。受線蟲危害的食用菌主要有：雙孢蘑菇、大肥菇、平菇、草菇、金針菇、黑木耳、毛木耳、銀耳等[6-9]。其中尤以雙孢蘑菇發生最普遍，危害最最重，線蟲危害時，床面菌絲生長受阻，嚴重萎縮死亡，料面發生黑褐色，料濕，發黏，出菇少，菇形小或不出菇，并有難聞的氣味，通常受害菇房的出菇期縮短，一般減少1～2潮菇，嚴重的生產季可縮短 1～2 個月，造成雙孢蘑菇減產20～50%[10-12]。在新疆，雙孢蘑菇產業是主要食用菌產業之一，每年栽培面積達60×104m2，多采用一次發酵或簡單的二次發酵生產方式，線蟲發生尤為普遍和嚴重。目前，在食用菌栽培過程中，線蟲危害問題往往比較突出，研究雙孢蘑菇栽培基質中線蟲分離方法，雙孢蘑菇線蟲的有效防控有重要意義。【前人研究進展】雙孢蘑菇栽培基質和覆土材料中線蟲分離方法主要為貝爾曼漏斗法。利用貝爾曼漏斗法分離培養料(堆肥)和覆土的線蟲，通過形態鑒定表明浙江省蘑菇生產中線蟲有3科(屬)5種，其中，主要為蘑菇菌絲線蟲(食菌莖線蟲)(DitylenchusmyceliophagusGoodey)、蘑菇堆肥線蟲(AphelenchoidescomposticolaFranklin)和小桿目線蟲(Rhabditata sp.)3種[13]。李發勇等[14]利用貝爾曼漏斗法分離培養料(堆肥)和覆土的線蟲，通過形態鑒定初步摸清了為害浙南地區蘑菇生產的主要線蟲種類為食菌莖線蟲、蘑菇堆肥滑刃線蟲和小桿線蟲；其發生條件和侵染途徑為舊菇房床架殘留線蟲以及后發酵溫控未能達到要求的培養料。【本研究切入點】新疆雙孢蘑菇生產方式多種多樣，生產用栽培基質種類多樣，線蟲病發生情況較為復雜。不同栽培基質類型中線蟲分離速率差異十分明顯，并且不同的生產方式和處理方法對線蟲發生數量影響很大，難以統一線蟲分離方法，按照文獻報道的線蟲分離和統計分析方法也難以反應本地雙孢蘑菇線蟲實際發生情況。目前，未見對不同栽培基質中線蟲分離速率和分離規律進行研究的報道。有關新疆雙孢蘑菇線蟲病的發生情況、發生規律等均未見報道。需確定分離雙孢蘑菇栽培基質中線蟲的科學方法，研究新疆雙孢蘑菇線蟲病的分布情況和發生規律。【擬解決的關鍵問題】研究不同栽培基質中線蟲分離速率和分離規律，評價影響分離速率的關鍵因子，分析不同生產方式和栽培基質處理方法對線蟲發生數量的影響，明確雙孢蘑菇線蟲分離的科學方法，為雙孢蘑菇線蟲病調查與研究提供理論基礎和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材 料

分別收集感染線蟲的雙孢蘑菇培養料和覆土材料。采集地點為三坪農場、阜康市九運街鎮、吉木薩爾縣、第六師共青團農場、第六師軍戶農場、溫泉縣等6個雙孢蘑菇主要種植區。表1

表1 樣品采集地點及生產方式

1.2 方 法

1.2.1 病樣采集

雙孢蘑菇培養料，分別采集雙孢蘑菇培養料發酵完成時和出菇期間的培養料；

雙孢蘑菇覆土材料，分別采集覆土材料消毒完成時和出菇期的覆土材料。

采用5點隨機取樣法，每個樣點取樣200 g，混勻后為1份樣品，用自封袋裝好帶回實驗室分離檢測。

1.2.2 基質材料中線蟲分離

每份樣品充分拌勻后，用天平稱取3份，各100 g，采用貝曼漏斗法進行線蟲分離，每24 h取一次線蟲懸液，用滅菌蒸餾水稀釋定容至10 mL，放置于劃有方格線的90 mm培養皿中，于顯微鏡下鏡檢，在顯微鏡下觀察和計數，每種實驗處理設3個重復。計算線蟲分離速率：

分離速率(%)=(單次分離線蟲數/線蟲分離總數)×100。

1.3 數據處理

應用Excel 2010軟件對數據進行數據處理、單因素方差分析(AVNOA)。

2 結果與分析

2.1 不同材料類型中線蟲分離速率

研究表明，不同基質材料類型中活體線蟲分離速率差異十分顯著，在分離24 h時，各基質材料分離速率由大到小依次為棉稈、麥草、棉籽殼和土壤材料，分離速率分別為86.05%、70.91%、37.98%和28.03%。

不同基質材料中線蟲分離速率達到最高的時間不同，其中，棉稈和麥草中線蟲分離速率均在24 h達到最高，分別為86.05%和70.91%，棉籽殼中線蟲分離速率在48 h達到最大，為37.98%，而土壤材料中線蟲分離速率在96 h達到最大，為28.03%。

不同基質材料中死體線蟲分離速率趨勢較一致，均是在活體線蟲分離較完全時開始逐漸被分離出來，且隨著時間延長分離速率呈增加趨勢。不同基質材料類型中線蟲分離速率差異顯著，活體線蟲先于死體線蟲被分離出來。圖1，圖2

圖1 不同基質材料活體線蟲分離速率

圖2 不同基質材料死體線蟲分離速率

2.2 不同材料類型中線蟲分離速率與材料孔隙度相關性

研究表明，不同基質材料孔隙度差異顯著，孔隙度由大到小的材料依次為麥草、棉稈、棉籽殼和土壤材料，其孔隙度依次為3.36、2.48、2.02和1.24 mL/g；線蟲分離速率與材料孔隙度相關性高，相關系數為0.799，R2=0.638 9。不同基質材料類型中活體線蟲分離速率與材料孔隙度相關程度很高，并呈正相關。表2，圖3

表2 不同基質材料孔隙度

圖3 活體線蟲分離速率與材料孔隙度的相關性

2.3 雙孢蘑菇培養料不同處理方法下線蟲濃度

研究表明，發酵處理完成時，不同處理方式處理的培養料中，線蟲濃度差異十分顯著，其中，實行工廠化二次發酵處理方式的培養料中線蟲濃度最低，為0條/100g，其次為實行半工廠化二次發酵處理方式的，為2.67條/100g，實行農法二次發酵處理方式的為33.33條/100g，而實行農法一次發酵處理方式的培養料中線蟲濃度最高，為1556.33條/100g；蘑菇出菇期，不同處理方式處理的培養料中線蟲數量均有所增加，且差異十分明顯，其線蟲濃度普遍較培養料剛發酵處理后的高很多，且差異與培養料發酵處理后的趨勢相似，其中，實行工廠化二次發酵處理方式的材料中線蟲濃度最低，為59.21條/100g，其次為實行半工廠化二次發酵處理方式的，為112.33條/100g，實行農法二次發酵方式的，為163.33條/100g而實行農法一次發酵方式的最高，為5371.33條/100g，呈爆發式發生。雙孢蘑菇培養料中線蟲多少與培養料處理方式密切相關，發酵處理越徹底，線蟲濃度越低。表3

表3 不同處理方式的培養料中線蟲濃度變化

2.4 不同生產方式下雙孢蘑菇覆土材料中線蟲濃度

研究表明，各地收集的經殺蟲處理后的雙孢蘑菇覆土材料中線蟲普遍存在，并差異顯著，活體線蟲濃度為每100g樣品中含線蟲12.00～79.00條；其中，三坪農場實行工廠化生產，覆土材料處理十分嚴格，線蟲濃度最低，為12.00條/100g，其次第六師軍戶農場實行半工廠化生產，覆土材料處理也較嚴格，為31.67條/100g，吉木薩爾縣實行農法生產方式，覆土材料處理較為粗放，線蟲濃度為45條/100g，阜康市九運街鎮實行實行農法生產方式，覆土材料處理最為粗放，其線蟲線蟲濃度最高，為79條/100g；蘑菇出菇后，各雙孢蘑菇覆土材料中線蟲數量普遍增加，且差異顯著，活體線蟲濃度為每100g樣品中含線蟲79.00～5 236.67條；其中，三坪農場實行工廠化生產，覆土材料中線蟲濃度最低，為79.00條/100g，其次第六師軍戶農場實行半工廠化生產方式，為132.53條/100g，吉木薩爾縣實行農法生產方式，線蟲濃度為153.33，阜康市九運街鎮實行實行農法生產方式，線蟲濃度最高，為5 236.67條/100g。雙孢蘑菇覆土材料中線蟲普遍存在，出菇后覆土材料中線蟲濃度普遍增加，且增加幅度與生產方式密切相關，生產方式越先進線蟲密度越小。表4

表4 不同生產方式下覆土材料中線蟲濃度

3 討 論

研究結果顯示，不同基質材料類型中活體線蟲分離速率差異十分顯著，在分離24 h時，各基質材料分離速率由大到小依次為：棉稈、麥草、棉籽殼和土壤材料，分離速率分別為86.05%、70.91%、37.98%和28.03%；不同基質材料中線蟲分離速率達到最高的時間不同，其中，棉稈和麥草中線蟲分離速率均在24 h達到最高，棉籽殼中線蟲分離速率在48 h達到最大，而土壤材料中線蟲分離速率在96 h達到最大；(3)不同基質材料孔隙度差異顯著，孔隙度由大到小的材料依次為：麥草、棉稈、棉籽殼和土壤材料，且不同基質材料類型中活體線蟲分離速率與材料孔隙度呈顯著正相關。線蟲分離速率受基質材料類型影響很大，應根據材料類型確定分離時間。

研究結果顯示，培養基質中線蟲濃度與生產方式和培養料處理方式密切相關，工廠化程度越高，培養料發酵處理越徹底，比如二次發酵，線蟲濃度越低；雙孢蘑菇覆土材料中線蟲普遍存在，出菇后覆土材料中線蟲濃度普遍增加，且增加幅度與生產方式密切相關，工廠化程度越高，線蟲密度越小。工廠化和半工廠化生產方式下，操作比較規范，對培養料、覆土材料、生產設施設備和房的殺蟲處理比較嚴格，出菇管理也比較科學，降低了蘑菇線蟲侵染的幾率，而農法生產方式下，操作比較粗放，對培養料、覆土材料、生產設施設備和菇房的殺蟲處理不到位，出菇管理也較為粗放，提高了蘑菇線蟲侵染的幾率，處理不當，往往會引起線蟲大爆發。改進雙孢蘑菇生產方式，改善培養料發酵方式(尤其是采用培養料二次發酵技術)，是預防雙孢蘑菇線蟲發生的有效措施，

4 結 論

不同基質材料類型中的活體線蟲分離速率差異十分顯著，且線蟲分離速率達到最高的時間不同，在分離24 h時，各基質材料分離速率由大到小依次為棉稈、麥草、棉籽殼和土壤材料，分離速率分別為86.05%、70.91%、37.98%和28.03%；不同基質材料類型中活體線蟲分離速率與材料孔隙度呈顯著正相關，孔隙度越大線蟲分離速率越快，線蟲分離速率達到最高的時間越早；培養基質中線蟲濃度與生產方式和培養料處理方式密切相關，工廠化程度越高，培養料發酵處理越徹底，比如二次發酵，線蟲濃度越低。線蟲分離速率受基質材料類型影響很大，應根據材料類型確定分離時間；改進雙孢蘑菇生產方式，改善培養料發酵方式(尤其是采用培養料二次發酵技術)，是預防雙孢蘑菇線蟲發生的有效措施。