有機-無機液體復合肥功能菌篩選及對設施番茄品質、生理活性的影響

許俊鋒，楊 蓉，詹發強，侯 敏，包慧芳，王 寧，龍宣杞，張志東，崔衛東

(1.新疆大學生命科學與技術學院，烏魯木齊 830001； 2.新疆農業科學院微生物應用研究所/新疆農業科學院新疆特殊環境微生物實驗室，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】生物多樣性水平降低，會使得土壤微生態系統失衡，農產品品質下降[1-2]。施用新型綠色環保生物有機-無機液體復合肥，加強水肥一體化施用管理，提高番茄果實品質，增強果實生理活性，在新疆綠色農業發展中具有重要意義。【前人研究進展】長期施肥易使土壤板結程度升高，農產品品質下降[3]；單施微生物菌劑可優化土壤有益微生物菌群結構，有益于作物品質提升，減少病害，但易缺乏植物生長所需營養[4]。細菌肥料可提高油茶果實產量[5]；增加豆類植物的蛋白質含量[6]；提升楊梅果實VC、糖酸比等[7]；微生物肥料可替代化肥提高蘋果品質，改善土壤環境[8]。【本研究切入點】多酚氧化酶(PPO)在果蔬加工中扮演著重要角色，能引起果蔬的酶促褐變，果蔬劣變，是導致果蔬加工、貯運困難的一個關鍵因素[9]。苯丙氨酸解氨酶活性可以作為果實抗逆境能力的一個重要指標[10]。抗壞血酸過氧化物酶在抗氧化防御系統中可以清除H2O2，降低植物體內活性氧的含量，在甘蔗等植物應對外界逆境脅迫時發揮重要作用，可以響應高溫、干旱、病害等環境脅迫[11]。當果實處于正常環境下，超氧化物歧化酶表達穩定，當處于高溫、低溫等外部不利環境條件時，超氧化物歧化酶含量升高，可減弱果實因機械損傷產生的影響，推遲果實衰老， 延長貯藏期[12]。目前有關有機-無機液體復合肥功能菌篩選及對設施番茄品質、生理活性的文獻較少。需研究功能性菌株與有機-無機液體復合肥在高滲環境下復配的問題。【擬解決關鍵性問題】篩選在高滲環境下穩定性好、活性較高的功能菌，制備生物有機-無機液體復合肥并在設施番茄中試驗，檢測番茄不同品質指標的變化，篩選最優菌肥配比及其對番茄果實品質、生理活性的影響，提高番茄果實抗逆能力和品質，為實現設施番茄種植水肥高效輕簡化管理提供依據。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌株

試驗于2020年9～11月在新疆烏魯木齊市烏魯木齊縣水西溝鎮南絲路北出天山有機食材餐廳1號大棚內進行，地理位置為43°49N，87°50E，屬典型的大陸性氣候。試驗大棚長60 m，寬6 m，壟長5 m，壟寬0.4 m，行距1 m。供試大棚日平均氣溫為25℃，夜平均氣溫為12℃，采用水肥一體化系統供水供肥，時間間隔為1周1次。

供試菌株為新疆農業科學院微生物應用研究所現有6種具有顯著的功能芽孢桿菌。

1.1.2 菌株篩選

將已保藏菌株干粉活化后轉接到斜面培養基，32℃培養20 h后備用。取一環活化菌種，接入裝有100 mL種子培養基的250 mL三角瓶中，32℃，120 r/min培養20 h。分別取5 mL種子液，接入裝有100 mL發酵培養基的250 mL三角瓶中(接種量為5 % ,V/V)。置32℃搖床中振蕩培養，轉速為120 r/min，定期采用稀釋平板法檢測生物有機-無機液體復合肥中活菌數。表1

表1 6種細菌種類及簡稱

1.1.3 供試培養基

斜面和平板培養基( g/L)：胰蛋白胨 10，酵母提取物 5，NaCl 10，水1 000 mL，瓊脂 15，pH 6.8～7.0，1×105Pa滅菌30 min；

種子培養基(g/L)：胰蛋白胨10 ，酵母提取物 5，NaCl 10，水1 000 mL，pH6.8～7.0，1×10P5a滅菌30 min；

發酵基礎培養基(g/L)：葡萄糖 2，酵母膏 0.5，玉米漿 7.5，KH2PO40.1，K2HPO40.1，MgSO4·7H20 0.05，水1 000 mL，pH 6.8～7.0，1×I05Pa滅菌30 min。

1.1.4 供試肥料

供試有機-無機液體復合肥(N=7.75 %、P2O5=17.59 %、K2O=26.02 %、總養分≥52 %)由新疆農業科學院土壤肥料與節水灌溉研究所提供。

1.1.5 供試番茄

采用番茄品種為桃態粉，由新疆膳源生態農業有限公司提供。

1.1.6 主要儀器

UV-1901型紫外可見分光光度計，杭州俊生科學器材有限公司；IMS-20型全自動雪花制冰機，北京澎昆博遠科貿發展有限責任公司；SPX-420BF-2型生化培養箱，上海福瑪試驗設備有限公司；搖床ZHWY-100D，上海智城儀器制造有限責任公司。

1.2 方 法

1.2.1 試驗設計

試驗設計7個處理，采用隨機區組設計，3次重復，滴灌方式澆水。番茄株距0.4 m，每壟面積2 m2。設置為CK(常規肥料，300 kg/hm2)、T1(有機-無機液體復合肥，300 kg/hm2)、T2(有機-無機液體復合肥，300 kg/hm2+菌液，7.5 L/hm2)、T3(有機-無機液體復合肥，300 kg/hm2+菌液，15 L/hm2)、T4(有機-無機液體復合肥，300 kg/hm2+菌液，22.5 L/hm2)、T5組(有機-無機液體復合肥，300 kg/hm2+菌液，30 L/hm2)、T6(有機-無機液體復合肥，300 kg/hm2+菌液，37.5 L/hm2)。在番茄2穗時期開始施用，日期分別為9月23日、10月2日、10月13日、10月27日。其中，生物有機-無機液體復合肥的施用方式為隨水施用，每個處理設置3個對照。于11月10日進行采摘，每組隨機選取大小相近色澤一致的成熟番茄20個，采摘后在實驗室檢測。

1.2.2 測定指標

活菌數：平板劃線法[13]、稀釋平板涂布法[14]。

番茄果實品質指標：可溶性糖含量采用蒽酮比色法[15]；pH采用雷磁pH計測定[16]；可滴定酸采用0.1 mol/L NaoH測定法測定[17]；可溶性蛋白采用考馬斯亮藍G-250染色法測定[18]；可溶性固形物采用折光法測定[19]；硬度采用硬度儀測定[20]；色差采用色差儀測定[21]；VC、番茄紅素采用試劑盒測定；天平稱單果質量(精確至1 g)[18]；用游標卡尺測定果實縱橫徑(精確至0. 01 mm)并記錄[22]。

番茄果實生理指標：多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)采用南京建成生物工程研究所試劑盒進行測量。

1.3 數據處理

數據通過Excel 2007整理后利用SPSS 13.0進行統計分析，采用origin 2019分析比較。

2 結果與分析

2.1 菌株穩定性檢測

研究表明，在進入高滲環境后，微生物大量死亡，呈現下降趨勢，但一定時間后，能逐漸適應并有效在有機肥中穩定存在。其中，貝萊斯芽孢桿菌LYT-5能較快適應有機-無機液體復合肥中高滲環境，穩定存在于有機-無機液體復合肥中。表2

表2 不同菌株芽孢在有機-無機液體復合肥中穩定表現

2.2 不同處理對番茄果實外觀品質的影響

研究表明，不同處理均能夠促進植株養分轉化，進一步促進果實膨大，施肥后番茄單果平均質量均呈上升趨勢，且T4處理后番茄單果均重最大；單果平均質量依次為T4>T5>T3>T6>T2>CK>T1；各處理果實橫徑、果實縱徑相較CK均有所提高，但處理組T3、T4、T5變化比較顯著，說明此處理菌液濃度能有效促進番茄植株的養分吸收與轉化，濃度適宜番茄生長需求；果形指數從CK組開始，呈現遞增趨勢，不同處理均能不同程度的促使番茄果形更加美觀。

T5處理后番茄果實硬度表現最好，較CK提高了4 %，硬度大小依次為T5>T2>T4>CK>T6>T3>T1；適宜菌液濃度能夠使番茄硬度增加，但是需要控制用量。番茄果實總色差值ΔE表示番茄果實色澤指標，總色差值隨著處理組施加菌液濃度的增加表現“增-降-增”的變化，T3處理最低，T6處理色差最高，較CK增加7 %，菌液能促使番茄果實中色素的產生與轉化，使番茄顏色更加鮮亮。表3

表3 不同處理下番茄果實外觀品質變化

2.3 不同處理對番茄果實營養品質的影響

研究表明，VC含量隨著處理組菌液的增加，總體上呈上升趨勢，其中，T6處理組VC含量最高，每毫克蛋白質較CK組多2.82 μgVC，增長量為5 %。隨著菌液的添加，番茄紅素在果實中的含量上升顯著，它能有效的提高番茄果實中番茄紅素的含量，其中T6處理組含量最高，較CK組增加0.29 μg/mL，增長16 %。

可溶性多糖與可滴定酸中對番茄果實品質影響較大，T4處理后兩者在試驗中都具有最高含量，分別為3.88和2.12 mg/mL，同時糖酸比比值增加到1.83，在各處理組中增速最大。T4處理組可溶性固形物含量占比6.47 %，較CK組增長為16 %。pH基本無變化。可溶性蛋白含量的測定是果實品質和營養價值的重要評定指標，T3組可溶性蛋白含量最高，較CK組多4.25 g/L，增長為36 %，LYT-5菌液能促進番茄蛋白質含量增加，且增幅顯著。表4

表4 不用處理下番茄營養品質變化

2.4 不同處理對番茄果實生理活性的影響

2.4.1 不同處理對多酚氧化酶(PPO)的影響

研究表明，生物有機-無機液體復合肥施加后，番茄果實中多酚氧化酶含量雖然有起伏，但總體上基本不變，在T5時達到峰值，此時含量為91 U/g，僅比CK組多4.89 U/g，施用生物有機-無機液體復合肥后，番茄果實多酚氧化酶含量基本無變化。圖1

圖1 不同處理下多酚氧化酶(PPO)變化

2.4.2 不同處理對苯丙氨酸解氨酶(PAL)影響

研究表明，在遭受寒冷、傷害等外界不利環境因素時，植物的防衛系統例如苯丙烷類代謝被激活，苯丙氨酸解氨酶活性快速上升，經過生物有機-無機液體復合肥施用后，T2和T3組中苯丙氨酸解氨酶含量大幅增加，分別為79.35和78.57 U/g，較CK組分別增加了219 %和216 %。此時果實能大幅度提高對外界傷害的抗性。圖2

圖2 不同處理下苯丙氨酸解氨酶(PAL)變化

2.4.3 不同處理對抗壞血酸過氧化物酶(APX)的影響

研究表明，T3處理組抗壞血酸過氧化物酶含量最高，為1.95 U/g，較CK組1.61 U/g增長21 %。該處理組果實能對加工和儲存時產生的逆境能夠及時響應，增加抗逆能力。圖3

圖3 不同處理下抗壞血酸過氧化物酶(APX)變化

2.4.4 不同處理對總超氧化物歧化酶(T-SOD)的影響

研究表明，超氧化物歧化酶在T4處理組含量為28.74 U/g，僅比CK組28.08 U/g多0.66 U/g，增長3 %。圖4

圖4 不同處理下總超氧化物歧化酶(T-SOD)變化

3 討 論

試驗結果表明，不同濃度的生物有機-無機液體復合肥施用會對番茄果實產生不同程度影響，與劉賓華[23]等研究的結論一致。與常規肥料相比，T4處理后番茄平均單果質量提升15 %，果形指數增長至0.87，生物有機-無機液體復合肥的合理配施后能增強番茄對養分的吸收與積累，可能是微生物通過代謝活動提供給植物有益的生存環境，不僅促使營養物質吸收、積累，產量增加，更使果形更加美觀。番茄果實硬度與色差變化較小，分別提升2 %、2 %，增幅與姜莉莉實驗結果近似[24]，生物有機-無機液體復合肥對番茄硬度、色差的影響不大。對番茄營養品質的檢測發現：番茄果實中VC含量基本無變化，僅提升4 %，遠低于韓順斌等[25]試驗結果，但可溶性多糖升高43 %，與韓順斌等試驗結果相差提高較大。不同種類微生物肥料可不同程度促進土壤中的營養元素轉化為植物可直接吸收利用的形態，促進植物體內營養物質的產生與積累，增加果實的營養品質，但對不同營養物質含量具有不同的增長效果。

在可滴定酸的檢測中，發現T4處理組含量最高，為2.12 mg/mL，較CK組增長7 %，同時糖酸比值最大，生物有機-無機液體復合肥可顯著提高番茄的可溶性總糖含量，但對可滴定酸含量影響不大，進而使糖酸比比值升高，與文獻研究中可滴定酸含量下降不同[26]，可能是試驗微生物代謝產物對番茄產酸能力影響不大。王書娟等[27]研究發現，微生物肥料的施用可提升可溶性固形物含量，但增幅低于本次試驗結果(16 %)。檢測發現T2、T3時可溶性蛋白最高，此時較CK組增加31 %、35 %，增長效果顯著，與前人研究結果相同[28]。

超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、多酚氧化酶等蛋白酶類的活性變化是評價番茄果實劣變程度的一個重要指標，能夠消除番茄果實細胞代謝產生的有害物質，有效減緩番茄果實腐敗變質。郝陽[29]等研究發現，微生物肥料能夠促進小麥、甘蔗等多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶等不同的酶活性升高，提高抗逆能力，微生物代謝過程中產生的一種或者幾種物質能夠被植物的免疫受體識別，激活果實多種抗性酶活性，提高免疫抗性。試驗結果已經證實。

4 結 論

貝萊斯芽孢桿菌LYT-5接入有機-無機液體復合肥中后，能穩定存活，可有效制備生物有機-無機液體復合肥，且合理配施后，能有效改善番茄果實品質，增強生理活性。施用生物有機-無機液體復合肥后，番茄果實多酚氧化酶和超氧化物歧化酶可增長6 %、4 %，T3時苯丙氨酸解氨酶含量可增加212%，抗壞血酸過氧化物增長21 %，果實的營養品質和抗逆能力顯著增強。在施用濃度達到T3(有機-無機液體復合肥，300 kg/hm2+菌液，15 L/hm2)后，番茄果實品質改善明顯，營養品質顯著提高，番茄果實采摘后適宜短期內食用、加工等。與CK(常規肥料，300 kg/hm2)相比，此濃度后番茄果實具有較高的生理活性，抗逆性強，為運輸保鮮減損方面奠定品質基礎。T3(有機-無機液體復合肥，300 kg/hm2+菌液，15 L/hm2)及以上濃度適宜番茄種植期間的田間施肥管理。