辣椒細菌性果實條斑病病原鑒定

張盧慧，趙志強，郭慶元

(新疆農業大學農學院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】辣椒(CapsicumannuumL.)種植面積最大的蔬菜作物之一[1]。新疆辣椒產業近年來發展速度非常快[2]，2019年新疆產區年種植辣椒總面積達到3.67×104hm2。近幾年辣椒病害逐年增加，制約著辣椒的品質及產量。發生于新疆巴州和碩縣辣椒種植區的辣椒細菌性條斑病是當地辣椒生產中發生普遍，危害較大的病害。【前人研究進展】國內外已報道的辣椒細菌性病害主要有細菌性瘡痂病、細菌性葉斑病、軟腐病、青枯病等，陳新等[3]報道引起辣椒細菌性瘡痂病的病原菌為野油菜黃單胞桿菌辣椒斑點病致病變種(Xanthomonascampestrispv.vesicatoria(Doidge)Dye)，該病害主要危害辣椒的葉片、莖、果實，侵染癥狀為圓形或不規則性、暗褐色、邊緣隆起中央凹陷的病斑，粗糙呈瘡痂狀，與辣椒細菌性斑點病極為相似。鄧剛[4]報道引起甘肅張掖地區番茄細菌性葉斑病的病原菌為丁香假單胞菌番茄致病變種(Pseudomonassyrinagepv.tomato(Okabe)Young,Dye&Wikie)，該病害主要危害葉片，危害癥狀為葉片產生深褐色至黑色不規則斑點，果實呈黑色隆起的小斑點，果實中央形成木栓化瘡痂，且該病原菌也可侵染辣椒。肖濟全[5]報道引起四川省廣元市辣椒軟腐病的病原菌為Erwiniacarotovorasubsp.Carotovora,該病害主要危害果實，病果初期出現水漬狀暗綠色斑，后期果實內部腐爛，果皮變白。周安韋[6]報道引起貴州地區的辣椒青枯病的病原菌為青枯勞爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)，該病害危害癥狀為初期全株葉片萎蔫，后期整株植株萎蔫枯死。【本研究切入點】針對辣椒細菌性病害的病原鑒定、致病機理與防治等進行了研究，而關于主要在果實上引起條斑的辣椒細菌性果實條斑病，尚未見到相關報道。2018年在新疆巴州和碩縣辣椒種植區內發現一種主要引起辣椒細菌性果實條斑的病害。該病害主要侵染辣椒果實、葉柄及嫩莖，以果實病斑最為顯著，葉片無明顯癥狀，發病的辣椒果實表面布有褐色的條形病斑。該病害的發病癥狀與國內外已報道的辣椒細菌性病害及辣椒條斑病毒病不同，是一種國內新發現病害，需進行病原鑒定。【擬解決的關鍵問題】采集田間病樣，采用組織分離純化、柯赫氏法則回接證病、形態學觀察和分子生物學鑒定的方法，研究發生于新疆巴州和碩縣辣椒種植區的辣椒細菌性條斑病的病原，為田間病害規律為病害防治提供依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

2018年在新疆巴州和碩縣辣椒種植區內紅龍23號品種上發現一種新的辣椒病害。在新疆巴州和碩縣辣椒種植區采集的多份辣椒果實病樣為供試樣品。

供試培養基：NA固體培養基:牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂17 g，蒸餾水1 L，pH調至7.2。

1.2 方法

1.2.1 噴菌現象觀察

田間采集辣椒病樣用自來水沖洗表面，晾干后切取病健交界處一小塊組織，在載玻片上滴加一滴蒸餾水，切取的組織置于載玻片上，蓋上蓋玻片，迅速將制好的玻片放在顯微鏡下觀察，以確認組織切口處是否有大量的細菌溢出。

1.2.2 病原菌的分離純化

田間采集回的辣椒病樣表面用自來水沖洗1min，用75%的酒精棉球擦拭表面并晾干后，在超凈工作臺內切取病健交界處一小塊組織(5 mm ×5 mm)，采用平板劃線法[7]分離組織，75%酒精浸泡表面消毒30s，1%次氯酸鈉浸泡表面消毒1 min，無菌水清洗3次，每次沖洗30～40 s，用滅過菌的濾紙吸干組織表面水分，在培養皿加入1 mL的無菌水，將病組織放入培養皿中并將病組織剪碎成小塊，靜置15～20 min，用接種環蘸取一環浸泡液進行平板劃線，28℃培養2 d后，挑取培養基表面長出的單菌落反復純化2～3次，純化2～3次后轉接到NA斜面試管上，4℃保存備用。

1.2.3 病原菌致病性

1.2.3.1 菌懸液制備

采用平板劃線法，將從田間病樣上分離、純化獲得的細菌菌株轉接于NA 固體培養基平板上，28℃活化培養48 h后，挑取培養基表面長出的單菌落轉接到NA培養液中， 28℃、160 r/min振蕩培養12 h，用無菌水將培養液稀釋成濃度約為108CFU/mL的菌懸液，供辣椒致病性回接和煙草過敏性反應測定用。

1.2.3.2 辣椒致病性回接

從田間采集的辣椒果實病樣中分離、純化共得到30個單菌落菌株。對30個分離菌株采用針刺接種法進行的致病性回接。將回接用的離體辣椒果實表面用自來水沖洗干凈，再用75%的酒精棉球擦拭辣椒表面，待辣椒表面晾干后，用一次性的2.5 mL無菌注射器吸取制備好的菌懸液，用針頭在健康辣椒果實表面針刺8～9個孔，在針刺的同時將菌懸液注入到針刺孔中，以針刺注射無菌水作為對照，將針刺接種后的辣椒果實及其對照置于有保濕濾紙的發芽盒中，28℃，恒溫、保濕培養，觀察辣椒果實表面發病情況。待辣椒果面發病后取發病組織再次組織分離，確認接種后致使辣椒果面發病的菌株是否與所接種的菌株一致。

1.2.3.3 煙草過敏性反應

選用室內種植的長有5～6片真葉的煙草葉片，用2.5 mL一次性無菌注射器吸取菌懸液，從離體煙草葉片背面針剌接種，以注入無菌水葉片作為對照，接種后的煙草葉片及其對照置于有保濕濾紙的發芽盒中，28℃，恒溫、保濕培養，觀察煙草葉片接種區域是否有過敏性枯斑出現，24～48 h內產生過敏性枯死斑的為陽性反應，72 h后才產生枯死斑的為陰性反應。

1.2.4 病原菌鑒定

1.2.4.1 形態學觀察及生理生化反應測定

在NA平板培養基上觀察供試菌株菌落特征，通過染色和鏡檢觀察菌體形態，參照《植物病原細菌鑒定試驗指導》[8]和《伯杰氏細菌鑒定手冊第八版》[9]測定菌株生理生化指標。

1.2.4.2 病原菌分子鑒定1.2.4.2.1 基因組DNA提取

采用文獻已報道的煮沸法[10]提取菌株的基因組DNA。用無菌槍頭挑取平板培養的單菌落，將單菌落轉到加有100 μL ddH2O的1.5 mL離心管中，沸水煮沸10 min，室溫冷卻5 min后，12 000 r/min離心5 min，離心后得到的上清液即為菌株基因組DNA樣品，將其置于-20℃保存備用。

1.2.4.2.2 16SrDNA基因擴增

采用16SrDNA通用引物27F/1492R[11]對提取出的4個供試菌株的DNA樣品進行16SrDNA擴增，上游27F序列(5'-3'端):AGAGTTTGATCMTGGCTCAG；下游1492R序列(5'-3'端)：GGYTACCTTGTTACGACTT；反應體系(25 μL)：2 x SanTaqPCR Mix12.5 μL、DNA模板2 μL、上游引物(10 μmol/L)1 μL、下游引物(10 μmol/L)1 μL、ddH2O 8.5 μL；反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環；最后72℃延伸10 min，擴增片段長度為1 500 bp左右。取5 μL PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至上海生工生物工程進行測序。獲得序列后，登錄NCBI網站，將測序獲得的菌株序列進行Blast同源性比對，比對后選取同源性高的序列，并從LPSN網站上下載模式菌株，采用 MEGA 7.0 軟件以鄰接法構建系統發育樹，以確定病原菌的種。

2 結果與分析

2.1 辣椒細菌性條斑病癥狀及發病特點

研究表明，該病害癥狀主要表現在辣椒果實、葉柄和嫩莖上，葉片無明顯癥狀。該病害在6～7月為高發期，發病初期莖部形成水漬狀斑點，后逐漸擴展成褐色條斑。以果實病斑最為顯著，且在果實中上部病斑較多，果實尖端病斑較少。病果實表面布有幾個至幾十個長短不一的黃褐色條形斑，以及尚處于侵染初期的褐色水浸狀斑點，病斑周圍無明顯的黃色暈圈。該病在田間有明顯的由初侵染斑點擴展為條斑，由短條斑擴展為長條斑的病斑擴展過程，有明顯的由輕病情很快擴展為重病情的侵染擴散現象，有蔭蔽高濕處發病較重的發病特點，有明顯的抗性差異，相似環境下有幾乎不發病的對該病表現為高抗的辣椒品種。病害樣品經室內顯微鏡觀察有明顯的噴菌現象，確定其為細菌性果實條斑病。圖1

注：a、b:田間自然侵染條件下辣椒表面發病癥狀；c:回接癥狀；d:CK；e:菌株煙草過敏性反應

2.2 病原菌分離及致病菌株篩選

研究表明，有4個菌株(KHL1、KHL4、KHL6、KHL9)表現出明顯的致病性，接種2 d后果面產生水漬狀小條斑；接種3 d后病斑顏色變深擴展成暗褐色長條形斑，病斑周圍無明顯的黃色暈圈；接種7 d后病斑連成片，果實面腐爛；室內針刺接種后的辣椒果面發病癥狀與田間辣椒果面發病癥狀相同，而用無菌水針刺的健康辣椒果面無發病癥狀。從接種發病病樣上再次分離得到的細菌形態特征與所接種的細菌形態特征一致；再分離菌株16SrDNA基因測序結果與所接種菌株16SrDNA基因測序結果一致，且4個菌株煙草過敏反應測定均為陽性。4個菌株(KHL1、KHL4、KHL6、KHL9)為辣椒細菌性條斑病的致病菌。圖2

注：a：菌落在NA培養基上的形態；b:菌體形態;c:菌體大小

2.3 形態學特征及生理生化性狀

研究表明，4個致病菌株在NA培養基上的菌落形態無差異，圓形、黃色、表面光滑有光澤、邊緣整齊，隆起且生長較快。4個致病菌株菌體為直或稍彎的短桿狀，G-，大小為0.34～0.50 μm×1.35～2.12 μm，有1根極生鞭毛，無莢膜，無芽孢。以4個菌株接觸酶反應、氧化酶反應、過氧化氫酶反應、硝酸鹽還原反應呈陽性，吲哚試驗呈陰性，不水解明膠。可利用D-果糖、葡萄糖、甘露醇、海藻糖、半乳糖、L-阿拉伯糖、乳糖、蔗糖產酸，不可利用麥芽糖、纖維二糖、菊糖、肌醇、木糖醇、山梨醇產酸。表1

表1 供試4個菌株生理生化特性測定結果

2.4 病原菌分子鑒定

研究表明，擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測均獲得1 500 bp左右的目標條帶，將擴增產物送至上海生工測序，其擴增片段大小分別為1 468、1 434、1 440和1 438 bp。將測序得到的4個菌株的核苷酸序列提交到GenBank中，分別獲得登錄號MW084715、MW084716、MW084717、MW084718。4個分離菌株均與P.argentinensis(登錄號：AY691189.2)、P.argentinensis(登錄號：NR043115.1)、P.argentinensisCH01T (登錄號：AY691188)聚在一個進化發育分支中，與模式菌株P.argentinensisCH01T (AY691188)的相似性達到了99.2 %。菌株KHL-1、KHL-4、KHL-6、KHL-9鑒定為P.argentinensis。圖3，圖4

注：M:2000 D Ladder marker；1-4：菌株KHL1、KHL4、KHL6、KHL9 16SrDNA擴增結果；CK:陰性對照

圖4 供試菌株KHL1、KHL4、KHL6、KHL9基于16SrDNA基因序列的系統發育樹

3 討 論

盛強[12]、鄧剛[13]、管晶晶[14]、Gappa-Adachi等[15]對不同地區發生的辣椒細菌性葉斑病的病原進行了鑒定，分別報道為黃褐假單胞菌(Pseudomonasfulva)、丁香假單胞菌甜菜致病變種(Pseudomonassy-ringaepv. Aptata)、丁香假單胞菌丁香致病變種(Pseudomonassyringae)、菊苣假單胞菌(Pseudomonaschicory)等病原細菌。在澳大利亞、美國、印度等國家，以及中國東北、內蒙古、山西、北京等地均有野油菜黃單胞桿菌辣椒斑點病致病變種(Xanthomonascampestrispv.vesicatoria)引起的辣椒細菌性瘡痂病的報道[16-18]。辣椒細菌性病害可由多種細菌性病原菌引起。孫福在等[19]報道細菌性葉斑病在辣椒莖稈及果實上的侵染癥狀主要表現為凸起的黑色斑點。Scott J W等[20]報道細菌性瘡痂病在辣椒果實上侵染癥狀為圓形或近圓形的黑色瘡痂斑，研究中新發現的細菌性條斑病在果實及莖稈上的侵染癥狀主要為褐色條形斑，病斑不凸起，與前人報道的辣椒細菌性病害有所不同，而國內文獻尚未有對該病害的報道。

Alvaro Peix等[21]于2005年從阿根廷科爾多瓦的土壤樣本中分離出一種新的假單胞菌屬物種，通過形態特征、生理生化測定結合分子鑒定方法將該物種鑒定為阿根廷假單胞菌(P.argentinensis)。該菌具有多樣性和廣泛性，可以從植物、土壤、動物、人體分離出來[22-24]。Pallavi Mansotra[25]、Manisha Phour等[26]研究報道該菌有增強植物的抗病性，促進作物在鹽脅迫下生長的功能，被作為PGPR菌株研究應用。Hariharan H等[27]報道該菌可以從動物的口腔中分離出來，能夠感染動物引發腦膜炎、腹膜炎等。Sameer A等[28]于2014年首次報道該菌從人體感染的皮膚中分離出來，造成人體皮膚感染。阿根廷假單胞菌作為一種致病菌，能夠侵染動物、人體，但引起植物侵染的病害少有報道，研究中引起辣椒侵染的阿根廷假單胞菌是否與引起人體、動物侵染的致病菌具有一樣的特性，還有待于進一步的研究。

致病菌株除了利用乳糖、蔗糖產酸結果不同外，其它生理生化特性結果均與阿根廷假單胞菌一致，可能與在不同環境中分離有關。在田間調查發現，發病的辣椒種植區栽植密度過大，尤其在一膜四行的中間行下部較為蔭蔽，不利于通過風、透氣、降溫，不利于作物的光合作用的地方，易造成病菌的侵入和感染；并且該種植區連續十幾年種植辣椒，長期單一連作會導致土壤中的有害菌的種類和數量增加，對植物易造成侵染。這些因素可能是造成該病害發生的因素，關于該病害的發病規律、寄主范圍等是今后研究工作的重點。

4 結 論

根據病害癥狀特點及田間發病特點和噴菌現象確定發生在新疆巴音郭楞蒙古自治州和碩縣辣椒種植區的辣椒病害為細菌性病害，是發生在辣椒上的一種新病害，擬以“辣椒細菌性果實條斑病”為病害名稱。經組織分離、純化、致病性測定形態學鑒定和分子生物學鑒定，確定該病病原菌為阿根廷假單胞菌(P.argentinensis)。