不同裂性葡萄品種果皮結構及代謝物質差異分析

王 敏，韓守安，張 雯，謝 輝，艾爾買克·才卡斯木，張付春，鐘海霞，弓佳琪，潘明啟

(1.新疆農業科學院園藝作物研究所/農業部新疆地區果樹科學觀測試驗站，烏魯木齊 830091；2 新疆農業大學科學技術學院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】2018年新疆葡萄種植面積15.02×104hm2(225.3萬畝)。新疆日照時間長，晝夜溫差大，產生有機物質多，葡萄品質獨特口感佳，但也容易發生裂果。葡萄品種間存在明顯地裂果敏感性差異，部分歐亞種葡萄品種成熟期果皮極易開裂，歐美種葡萄品種極抗裂，木納格、無核白、無核紫、里扎瑪特等成熟期遇到降雨會造成裂果、落粒嚴重[1-2]。裂果是果實內部壓力增大超出果皮承受范圍，植物自身應對生理失調所作出反應的一種生理性病害。裂果發生后會果汁外溢，微生物侵染，導致果實大面積腐爛，降低了果實商品價值。【前人研究進展】對荔枝[3]、西瓜[4]、棗[5]、番茄[6]等易裂果品種研究發現，裂果發生時細胞壁組分中果膠和纖維素等在水解酶的作用下水解，使果皮力學強度減弱并導致裂果。對杏[7]、棗[8]的研究發現，成熟期果皮細胞發生凋亡，細胞質膜相對透性增大，果皮外部自由水分大量進入果肉中，引起果肉細胞膨脹而裂果。【本研究切入點】不同品種之間裂果差異性很大。需對比分析葡萄品種紅地球、新郁、里扎瑪特、無核紫、木納格5個不同裂性差異。【擬解決的關鍵問題】以紅地球、里扎瑪特、新郁、無核紫、木納格5個葡萄品種為材料，測定原果膠(Protopectin，SP)、水溶性果膠(Water-soluble pectins，WSP)、半纖維素(Hemicellulose)細胞壁組分含量及多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase，PG)、果膠甲酯酶(rapidasepep rapidase，PEP)、果膠裂解酶(Pectate lyases，PL)、纖維素酶(Cellulase，CE)細胞壁水解酶等組分，分析果皮解剖結構、細胞凋亡情況，研究不同品種從轉色期至成熟期裂果特性的調控因子，為易裂果葡萄品種在新疆高效栽培提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材 料

材料取自新疆農業科學院綜合試驗場。2018年8月上旬～9月下旬(果實轉色期至成熟期)，每10 d采集1次樣品，共計采樣3次，分別記錄為花后70 d、花后80 d、花后90 d，以樹勢生長一致的新郁、紅地球、里扎瑪特、無核紫、木納格為材料，供試樹于2012年定植，株行距1 m×3 m，南北行向，正常管理。

采收無病害長勢均勻完整葡萄果實果穗，放入冰盒內，迅速帶回實驗室。在果穗上中下隨機取樣分份，液氮冷凍后置于-40℃冰箱內保存。從葡萄果實中部切去取1 cm3小塊，固定于FAA固定液(50%酒精)用于石蠟切片及細胞凋亡檢測。

1.2 方 法

參考王旭旭等[9]方法，5個品種于3個采樣日期分別采集150粒果粒，隨機分為3組裝入紗網袋內(每個沙網袋50粒)，浸泡于清水中，浸泡24 h后統計裂果率。

裂果率=(裂果粒數/總粒數)×100%。

果膠、原果膠、纖維素、半纖維素，PG、PEP、CE、PL等果膠、纖維素降解關鍵酶酶活性測定，使用酶聯免疫分析(ELISA)試劑盒反應后酶標儀測定吸光度。

果皮解剖結構觀察及細胞凋亡測定Tunel一步法(碧云天生物技術有限公司)，OLYMPUS光學顯微鏡下觀察、成像，使用imageJ軟件測量。

1.3 數據處理

采用SPSS19.0和Excel2013軟件對數據進行處理統計分析及作圖，采用Duncan新復極差法(SSR)進行結果差異顯著性檢驗，顯著水平為P< 0.01，分析相關性。

2 結果與分析

2.1 5個葡萄品種不同時期裂果率差異

研究表明，5個品種之間浸水裂果率在轉色期至成熟期差異明顯，紅地球為不裂果品種，3個時期浸果24 h均未出現裂果；里扎瑪特為最易裂果品種，3個時期浸果裂果率均為幾個品種最高值，采收期裂果率達到99.33%；無核紫、木納格、新郁3個品種浸果24 h花后70 d裂果率分別為43.33%、38.67%、44.00%，花后80 d裂果率分別56.67%、52.67%、52.00%，花后90 d采收期裂果率分別為63.33%、62.00%、64.67%，差異未達到顯著水平，與品種之間特性相符，紅地球為最不易裂品種，里扎瑪特為極易裂品種，無核紫、新郁、木納格均為易裂品種。表1

表1 不同葡萄品種清水浸果裂果率

2.2 5個葡萄品種不同時期果膠、原果膠、半纖維素變化差異

研究表明，隨著果實逐漸成熟，原果膠含量整體曾遞增趨勢；里扎瑪特隨著時間推遲增幅不明顯；新郁、紅地球、里扎瑪特、木納格、無核紫花后80～90 d原果膠含量增幅分別為4.7%、31.6%、1.1%、-14.6%和15.6%，紅地球增幅最高且采收時含量最高；新郁、木納格花后70 d至花后80 d含量增加顯著，木納格花后80 d至花后90 d含量降低；無核紫3個時期增幅不顯著。隨著果實逐漸成熟，水溶性果膠含量曾遞增趨勢；新郁、紅地球、里扎瑪特、木納格、無核紫花后70～90 d水溶性果膠含量增幅分別為80.8%、26.1%、67.2%、47.9%、79.6%，紅地球增幅最低且花后90 d含量顯著低于除無核紫外的3個品種，新郁、里扎瑪特、木納格含量分別是紅地球的1.41、1.34、1.37倍；無核紫在花后80 d果膠含量高于花后90 d，各個時期果膠含量整體低于其他幾個品種。水溶性果膠/原果膠比值，紅地球呈現降低趨勢；里扎瑪特從花后80 d至花后90 d增幅達到64%，顯著高于其他品種；木納格呈現先增后降趨勢。新郁、紅地球、里扎瑪特、木納格、無核紫花后70～90 d半纖維素含量增幅分別為0.8%、-5.9%、134.7%、38.1%、79.3%，隨著采樣日期的推移里扎瑪特半纖維素含量顯著升高，紅地球半纖維素含量先增加后降低，隨著果實成熟則變化不顯著；里扎瑪特半纖維素含量與紅地球相比花后70、80、90 d，分別為0.79、0.54、1.35倍。圖1

圖1 不同葡萄品種不同時期細胞壁代謝物質變化

2.3 5個葡萄品種不同時期PG、PEP、CE、PL酶活性變化差異

研究表明，PG(多聚半乳糖醛酸酶)酶活性隨著果實的成熟酶活性逐漸升高；紅地球酶活性在3個時期均為5個品種最低值；里扎瑪特與無核紫在花后90 d酶活性顯著高于與其他品種。PEP(果膠甲酯酶)酶活性隨著果實的成熟酶活性逐漸升高，每個時期各品種之間含量無明顯差異。PL(果膠裂解酶)酶活性隨著果實發育整體呈現上升趨勢；花后70 d、花后80 d活性變化不大，到花后90 d采收期時達到最大值，酶活性差距變大，5個品種中只有紅地球在采收期酶活性下降，里扎瑪特在采收期酶活性為5個品種中最高。5個品種纖維素酶活性整體都是曾增高趨勢，花后90 d達到最高值，只有不易裂品種紅地球CE(纖維素酶)酶活性花后80 d達到最高值，到花后90 d酶活性下降，是5個品種中唯一有下降趨勢的品種。圖2

圖2 不同品種不同時期細胞壁代謝酶活性變化

2.4 采收期細胞結構變化差異及細胞凋亡程度

研究表明，5個品種之間凋亡程度與裂果率存在正相關關系。里扎瑪特最易裂果，細胞凋亡情況最明顯，角質膜層凋亡重，染色深；亞細胞內部細胞質染色變深黃甚至偏黑，細胞與細胞之間的細胞質也被染色明顯，細胞凋亡度最高，細胞損傷度最高。無核紫采收時期相較其他品種更晚，采收時有成熟過度情況，凋亡程度很嚴重，從角質層到亞表皮細胞都被染色較深，但是角質層染色區域少，凋亡明顯。木納格易裂果，細胞質被染成黃色，凋亡也比較明顯。新郁從細胞質到表皮細胞亞表皮細胞均有被染色，但面積不大，凋亡程度比其他品種淺，亞表皮細胞之間由于胞間質降解出現空腔。紅地球作為最抗裂品種，整體染色呈現為藍色，凋亡度最弱，細胞結構整齊無損傷。圖3

注：→空腔 角質膜層明顯凋亡

研究表明，裂果與果皮解剖結構密切相關。里扎瑪特角質層達到4.12 μm，顯著厚于其它品種，但角質層極不平整，有斷裂和缺口處；表皮細胞截面積422.44 μm2，顯著高于除新郁外的品種；亞表皮細胞截面積為1 905.43 μm2，僅高于無核紫，但細胞不規則，排列松散，細胞間隙明顯。紅地球角質層平整且光滑，亞表皮細胞排列規則且緊密，細胞間無明顯間隙。新郁表皮細胞526.16 μm2及亞表皮細胞橫截面積3 235.23 μm2顯著高于其他品種，角質層較不平整，有少量的缺口，細胞不規則，排列松散，細胞間間隙明顯。木納格、無核紫角質層不平整，有少量缺口，木納格亞表皮細胞排列比較規則，排列緊密；無核紫亞表皮細胞排列不規則，排列比較松散，表皮細胞橫截面積219.55 μm2、亞表皮細胞橫截面積608.76 μm2顯著低于其他品種。表2

表2 成熟期不同品種果實表皮結構及差異性

3 討 論

植物細胞壁是由眾多不同分子組成復雜而動態結構，將單個細胞圍住有助于保持細胞形狀的機械強度，為細胞擴張提供了空間[10]。細胞壁的基本框架主要由纖維素微纖維和半纖維素多糖(如木聚糖)組成，并嵌入果膠的復雜基質中；細胞壁代謝相關的水解酶主要包括纖維素酶、果膠甲脂酶、果膠裂解酶、多聚半乳糖醛酸酶等，果膠裂解酶和多聚半乳糖醛酸酶主要的生理作用是分解果膠類物質，并破壞與果膠類物質形成的果膠酸鈣，減弱細胞間相互作用力[11，12]。纖維素是細胞壁主要成分之一，纖維素酶主要作用是降解纖維素，降低細胞壁的機械強度。王保明等[8]發現在易裂棗果實生長過程中原果膠、纖維素含量降低，水溶性果膠含量增加；裴健翔[13]研究發現，噴鈣處理降低了蘋果果實代謝酶活性，抑制了原果膠及纖維素降解、可溶性果膠上升；李建國[14]研究發現，易裂荔枝果皮中果膠酶、纖維素酶、果膠甲酯酶等水解酶活性比不易裂品種高，且果膠酶差異最明顯；張川[6]等研究發現，隨著番茄果實的成熟細胞壁降解酶大量合成，導致易裂果品種中代謝酶類組成可溶性蛋白含量高于耐裂果品種；郭紅彥[15]不同時期葉面噴施鈣能夠降低裂果率，降低代謝酶活的含量，提升了原果膠與纖維素的含量。

研究發現，葡萄果實從轉色期至成熟期采收前，細胞壁結構物質、細胞水解酶曾遞增趨勢；紅地球的原果膠含量采收期含量高于其他易裂品種且花后80至90 d增幅顯著高于其他易裂品種，在取樣的3個時期紅地球水溶性果膠的含量低于其他易裂品種且花后70～90 d增幅顯著低于其他品種，原果膠與水溶性果膠的比值持續降低，在采收期果膠裂解酶酶活性下降，果膠酶叫其他易裂品種3個時期均含量偏低；在果實成熟期易裂品種在細胞壁代謝相關酶果膠酶和果膠裂解酶的作用下降解細胞壁結構多糖，果膠轉化為水溶性果膠，降低了果皮的強度及細胞壁的延伸性進而誘導了裂果的發生。耐裂品種紅地球半纖維素含量先增加后降低，果實成熟變化不顯著，但是采收期纖維素酶含量不增反減，果皮強度保持不明顯降低，裂果不易發生；但易裂品種里扎瑪特的半纖維素含量在成熟期確顯著升高，原因是纖維素轉化為半纖維素后果皮強度下降，導致裂果的發生。纖維素酶將纖維素分解轉化為半纖維素，細胞壁代謝相關物質半纖維素含量及其相互交聯是果皮強度的重要物質基礎，與果實裂果發生密切相關。此研究結果與前人結果研究一致[13-16]。研究中酶活性未達到顯著性水平。

細胞凋亡是指為維持內環境穩定，由基因控制的細胞自主有序死亡主動過程[17]。果皮細胞隨著果實的成熟期會發生明顯凋亡現象，致使果皮結構破壞，果皮強度降低，導致裂果，研究中能明顯看到4個易裂品種在采收期均出現不同程度的細胞凋亡現象，極易裂品種里扎瑪特凋亡程度最重，細胞老化衰亡嚴重，細胞完整度不好，易裂品種無核紫、新郁、木納格也出現不同程度凋亡，紅地球基本沒有表現出凋亡現象。

果實表皮細胞大小及排列度、角質層表皮細胞厚度等對決定的抗裂能力具有重要作用，角質層是有效的水分屏障，出現明顯的斷裂和缺口時，致使水分滲透，導致裂果發生[18]。龐洪翔[19]等發現易裂葡萄品種木納格角質層、表皮與亞表皮較厚，表皮細胞排列松散不規則，不易裂品種巨峰、玫瑰香細胞排列較規則、緊密。劉世鵬等[20]發現，裂果指數與其角質層細胞密度、表皮厚度、環腕部表皮最厚處、最薄處細胞厚度具負顯著相關性。王保明[8]等發現在成熟期棗果肉細胞增大且排列松散、大小不規則，具有明顯的空腔現象。研究顯示，易裂品種角質層不平整有斷口與缺鏈，表皮細胞排列松散，亞表皮細胞排列不規則，細胞間有間隙，與前人研究結論一致[21-23]。

4 結 論

隨著葡萄果實的成熟，原果膠含量最高且采收前10 d至采收期原果膠含量增速達到31.6%顯著高于易裂品種里扎瑪特的1.1%，易裂品種新郁、里扎瑪特水溶性果膠含量增速達到80.8%、67.2%顯著高于不易裂品種26.1%，易裂品種里扎瑪特半纖維素含量顯著升高含量增幅達到134.7%，易裂品種紅地球成熟期含量下降增幅為-5.9%。隨著果實成熟易裂品種在細胞壁代謝相關酶的作用下降解細胞壁結構多糖，果膠轉化為水溶性果膠，纖維素轉化為半纖維素，致使角質層不平整出現斷口與缺鏈，細胞出現凋亡，降低了果皮的強度及細胞壁延伸性，誘導了裂果發生。