有機硒化合物乙烷硒啉抑制腺樣囊性癌細胞生長的體外研究

邢鳳霞，張 強，盧國徽，趙艷芳，周 瓊

（北京大學第三醫院北方院區口腔科，北京 100089）

硒是一種人體必需的微量元素，在機體內發揮著多種生理功能，比如抗氧化損傷、解毒、增強免疫力等。流行病學研究提示，血清硒濃度與腫瘤發生率、死亡率之間呈負相關[1]。因此人們設計合成了多種含硒化合物抑制腫瘤[2]。但是這些含硒化合物的毒副作用也限制了其在腫瘤治療中的應用[3]。因此，北京大學藥學院師長進等[4]合成了一種高效、低毒的有機硒化合物-乙烷硒啉（1,2-[ 二(1,2-苯并異硒唑-3(2H)-酮)]乙烷，BBSKE）。體外研究顯示，BBSKE對多種腫瘤細胞，如肝癌Bel-7402、白血病HL-60、鼻咽癌KB、宮頸癌HeLa、胃癌BGC-823等細胞系有明顯抑制作用；動物實驗表明，BBSKE明顯抑制肺癌、前列腺癌等的生長[5-6]。腺樣囊性癌是最常見的涎腺惡性腫瘤之一，易沿神經擴散，浸潤性極強，肺轉移率高。雖然可長期帶瘤生存，但其遠處轉移和復發率較高，且對多種化療藥物均不敏感。基于此，本研究探討BBSKE對腺樣囊性癌細胞生長的抑制作用及機制，將有助于腺樣囊性癌的輔助治療。

1 材料與方法

1.1 試劑 乙烷硒啉(北京大學有機硒藥物研究中心，分子量422.2，含量＞98.5%)，用二甲基亞砜（DMSO）（上海吉至生化科技有限公司）制成20 mmol/L儲存液，20 ℃分裝保存。3(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）；無血清細胞凍存培養基（RPMI 1640）（GIBCO公司）；胎牛血清（北京元亨圣馬生物技術研究所）；[5,5－二硫雙（2－硝基苯甲酸）](DTNB)和還原型輔酶Ⅱ（NADPH）購自Sigma公司。本實驗經北京大學第三醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 細胞培養 人腺樣囊性癌細胞系（SACC-83、SACC-LM）由本實驗室建系。細胞用含15%胎牛血清，100 U/ mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養液；于37 ℃、飽和濕度、5% CO2條件下培養。

1.3 細胞增殖分析 用MTT法[7]觀察BBSKE對SACC-83、SACC-LM細胞增殖活性的影響。對數生長期SACC-83、SACC-LM制備細胞懸液，按5×103個/孔，180 μL/孔，接種于96孔板。24 h后吸取上清液，更換為含不同濃度BBSKE的細胞培養液，陰性對照組含0.1%的DMSO，每一濃度設置6個復孔，繼續培養24、48、72 h。培養結束前每孔加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT，繼續培養4 h，吸盡培養液后每孔加入150 μL DMSO，37 ℃，100 r/min震蕩10 min，充分溶解結晶后用酶標儀 (USA，型號：BIO-Tek Elx808)于570 nm波長下測每孔的吸光度（A值）。計算細胞存活率[細胞存活率=加藥組平均A值/對照組平均A值）×100%]及抑制腫瘤細胞生長達到50%時的藥物濃度（IC50）。以上實驗重復至少3次。

1.4 赫斯特（Hoechst）熒光染色 用Hoechst熒光染色法[8]觀察BBSKE對SACC-83、SACCLM細胞形態變化的影響。對數生長期SACC-83、SACC-LM制備細胞懸液，按2.5×105個/孔接種于D60 mm的培養皿。24 h后吸去上清液，更換為含10 μmol/L BBSKE的細胞培養液，陰性對照組含0.1%的DMSO，每一濃度設置3個復孔，繼續培養24 h。之后用0.25%的胰蛋白酶消化收集細胞，采用Hoechst染色，熒光顯微鏡(200倍)觀察細胞形態變化。

1.5 半胱氨蛋白水解酶-3（Caspase-3）活性檢測 SACC-83、SACC-LM細胞經不同濃度的BBSKE處理48 h后，按Caspase-3活性檢測試劑盒（Promega公司）說明，加入細胞裂解液1×108個細胞/mL提取蛋白，Brandford法定量（普利萊公司）。50 μg蛋白加入2 μL底物，37 ℃孵育4 h后在酶標儀405 nm波長處檢測吸光度值。以上實驗重復2次，取平均值進行統計學計算。

1.6 硫氧還蛋白還原酶（TrxR）活性檢測 采用DTNB法 測 定 TrxR 活 性[9]。SACC-83、SACCLM細胞經不同濃度的BBSKE（每個濃度2個平行樣）處理48 h后加入蛋白裂解液 [25 mmol/L 三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl） (pH=7.4)，137 mmol/L 氯化鈉，1% 聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100），1% 脫氧膽酸鈉，10mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA），0.1% 十二烷基硫酸鈉（SDS）]提取蛋白，Brandford法蛋白定量后，在半微量比色池中加入0.3 mmol/L 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）、10 μg細胞蛋白，用0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液調節最終體積至100 μL[DTNB的體積]。加入150 μmol/L DTNB啟動DTNB二硫鍵還原反應，立即在核酸/蛋白檢測儀（Beckman Coulter DU730）412 nm處測定吸光度值，每10 s測定1次，連續測定10 min，記錄吸光度值的變化量。

1.7 統計學分析 采用SPSS13.0統計學軟件進行數據處理，計量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BBSKE對腺樣囊性癌細胞系SACC-83、SACC-LM細胞增殖的抑制作用 MTT實驗結果顯示，BBSKE對SACC-83、SACC-LM細胞的增殖均有抑制作用。不同濃度的BBSKE對SACC-83、SACC-LM細胞生長的抑制作用呈劑量依賴性和時間依賴性。BBSKE作用于SACC-83和SACC-LM腺樣囊性癌細胞 72 h，IC50分別為 12 μmol/L 和 10 μmol/L，見圖1。

圖1 BBSKE對腺樣囊性癌細胞系SACC-83、SACC-LM細胞增殖的抑制作用

2.2 BBSKE對SACC-83、SACC-LM細胞形態變化的影響 細胞凋亡的特征性形態學變化主要包括細胞皺縮、染色質凝集、凋亡小體形成。10 μmol/L的BBSKE作用SACC-83、SACC-LM細胞24 h，細胞均出現細胞凋亡相應形態變化，結果顯示，BBSKE對SACC-83、SACC-LM細胞均有凋亡誘導作用，且SACC-LM細胞凋亡發生更為敏感，見圖2。

圖2 BBSKE對SACC-83、SACC-LM細胞形態變化的影響

2.3 不同濃度BBSKE對SACC-83、SACC-LM細胞中Caspase-3活性的影響 以0 μmol/L為對照，采用3種不同濃度的BBSKE作用SACC-83、SACCLM細胞48 h，檢測Caspase-3活性（405 nm處的吸光度值）。隨著BBSKE濃度增大，Caspase-3活性升高，且SACC-LM比SACC-83細胞升高更為明顯，見圖3，SACC-83 細胞：5 μmol/L組與對照組Caspase-3活性相比無明顯變化，其相對活性分別為（1.27±0.16）和 1.00，而 10 μmol/ L組和20 μmol/L組Caspase-3相對活性分別為（1.44±0.18）和（1.8±0.04），顯著高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)；SACC-LM細胞：5 μmol/L 組、10 μmol/L 組 和 20 μmol/L組Caspase-3相對活性分別為（2.89±0.07）、（2.75±0.49）和（3.14±0.09），顯著高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)。

圖3 不同濃度BBSKE對SACC-83、SACC-LM細胞中Caspase-3活性的影響

2.4 BBSKE對SACC細胞TrxR活性的影響 3種不同濃度的BBSKE作用SACC-83、SACC-LM細胞48 h后檢測TrxR活性。SACC-83細胞：BBSKE對其TrxR活性無明顯的影響；SACC-LM細胞：隨著BBSKE濃度增大，TrxR活性明顯降低。BBSKE 5 μmol/L 組、10 μmol/L 組 和 20 μmol/L組的TrxR活性（λ=412 nm處的吸光度值）分別為（0.113±0.003）、（0.088±0.007）、（0.046±0.017），見圖4。

圖4 BBSKE對SACC細胞TrxR活性的影響

3 討論

本研究證實，新型有機硒化合物BBSKE對腺樣囊性癌有抑制作用。其作用靶點是TrxR，通過抑制TrxR活性抑制癌細胞的增殖[10，13]。硫氧還蛋白（Trx）系統(TrxR、Trx、NADPH)是普遍存在于細胞內的氧化還原系統，在體內發揮著重要的抗氧化和氧化還原調控等作用[11]。Trx系統在促進腫瘤細胞增殖和抑制腫瘤細胞凋亡中發揮著重要作用。近年來，研究發現多種腫瘤細胞中的TrxR在轉錄和蛋白的表達水平都有所增加[12]。因此，控制癌細胞中的TrxR活性至關重要。含硒化合物可調節TrxR的活性。本實驗發現，BBSKE對腺樣囊性癌細胞的增殖也有抑制作用，且在其他細胞系中也有類似的結果[10-14]。

BBSKE可以調控細胞周期相關蛋白，如細胞周期蛋白A（cyclinA），細胞周期蛋白E（cyclinE），細胞周期抑制蛋白P21，細胞周期蛋白B1（cyclinB1），細胞周期蛋白D1（cyclinD1），細胞周期蛋-依賴性蛋白激酶4（Cdk4）等，使腫瘤細胞阻滯在細胞周期S期而抑制腫瘤細胞增殖；也可調控增殖、凋亡相關蛋白B淋巴細胞瘤-2基因（Bcl-2）、核轉錄因子κB（NF-κB）和半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase3）促進腫瘤細胞凋亡[13]。Caspase-3是細胞凋亡的末端信號分子，其在決定細胞是否凋亡中起著重要作用。

同時，由于許多腫瘤細胞中TrxR表達水平高于正常細胞，所以BBSKE能特異性選擇殺傷腫瘤細胞，而對正常細胞的損傷很小。在不同的研究中發現，相同作用條件下，BBSKE 對正常肝細胞系HC7701(IC50-24 h∶53.83 μmol/L)的生長抑制作用比腫瘤肝細胞系Bel-7402 (IC50-24 h∶32.41 μmol/L)小；BBSKE對人胚胎肺二倍體細胞系CCC-HPF-1（IC50-24 h＞40 μmol/L）生長抑制作用明顯低于肺癌細胞系 A459(IC50-24 h ∶ 7 μmol/L)[6，13]。BBSKE比亞硒酸鈉具有更好的組織耐受性及低毒性，BBSKE還可通過增加正常及腫瘤鼠的相對脾重、脾淋巴細胞轉化活性、自然殺傷細胞(NK)活性等，顯著提高機體免疫力[14]。而染色體畸變試驗證實BBSKE無致突變作用[15]。

本研究發現，BBSKE可以抑制腺樣囊性癌細胞的增殖，且對腺樣囊性癌高轉移細胞系SACC-LM更為敏感。其作用機制可能是通過抑制細胞中TrxR的活性，升高Caspase-3活性實現的。但是BBSKE是否可以在體內抑制腺樣囊性癌的生長或轉移則需要人體內試驗進一步驗證。