單羧酸轉運蛋白（MCT）的功能調控及生理特性研究

張 維，嚴漢池

（天津大學生命科學學院，天津 300072）

單羧酸鹽轉運蛋白（MCT）屬于溶質載體（SLC）轉運蛋白家族，由溶質載體家族16 成員（SLC16A）編碼。迄今為止，已在所有基因組測序的真核生物中鑒定出MCT。該蛋白家族由14 個成員組成，依次命名為MCT1~14，其命名方式與SLC16 的編號不一致，SLC16 是根據cDNA 序列的獲得來命名，而MCT是按照功能的表征順序來命名，本研究主要以MCT的命名方式為主。MCT 蛋白主要負責單羧酸類物質，如乳酸、丙酮酸和酮體等的跨膜轉運，也可運輸激素、氨基酸等，促進營養物質吸收，維持細胞內的代謝平衡，同時可以調節胞內pH 以及參與藥物運送等。MCT 家族成員各亞型間具有組織分布特異性和底物差異性，它們也參與多種生理和病理過程，如腫瘤細胞的能量代謝、氧化磷酸化、糖異生、甲狀腺激素代謝等［1］的發生過程。本研究主要對MCT 家族的結構功能、調控蛋白以及腫瘤代謝中的生理作用和作為腫瘤治療潛在靶點的用途進行了總結，為以MCT 為靶點的抑制劑及藥物的發現提供參考。

1 單羧酸轉運蛋白家族的表達調控與結構功能

1.1 轉錄與表觀遺傳調控

人類MCT1 啟動子在21 世紀初被鑒定和表征，并且在啟動子區域內已經鑒定出一系列轉錄因子的潛在結合位點，包括USF1、USF2、AP1、AP2、SP1、MZF1 和活化B 細胞的核因子κ-輕鏈增強子（NFκB）［2，3］。人類MCT1 啟動子包含USF1 和2 個結合位點，在功能上抑制人類結腸腺癌細胞Caco-2 中的MCT1 轉 錄，而遠 端SP1 位點 刺激 啟動 子活性［2］。NF-κB 抑制劑逆轉丁酸對人類腺瘤衍生（AA/C1）細胞中MCT1 啟動子活性的刺激作用，表明NF-κB 途徑參與MCT1 轉錄調控［4］。對于MCT4 轉錄調控的研究很有限，且研究表明Nrf2 和c-Myc 轉錄調控MCT1，但不調控MCT4［5，6］。對MCT4 啟動子進行定點突變后，缺氧誘導因子1α 亞單位（HIF1α）會結合啟動子并誘導MCT4 mRNA 表達［7］，表明啟動子內的缺氧反應元件對HIF1α 介導的MCT4 轉錄激活至關重要［8］。NF-κB 途徑會受到腫瘤壞死因子-α 的調控，使得人臍靜脈內皮細胞中MCT9 mRNA 表達增加［9］，但是沒有進行啟動子分析，以確定MCT9 啟動子是否包含假定的轉錄因子結合位點。關于其他MCT 轉錄調控的信息非常有限。

MCT1基因的表達也可以通過表觀遺傳的方式調節，這取決于細胞、組織類型以及代謝需要。在骨骼肌中，由于慢性刺激或運動導致的Ca2+和一磷酸腺苷（AMP）水平的增加會增加MCT1 轉錄，并促進Ca2+依賴性蛋白磷酸酶-鈣調神經磷酸酶（CaN）和AMP 活化蛋白激酶（AMPK）的活性［10，11］，主要是因為CaN 負責活化T 細胞的核因子（NFAT）的去磷酸化和活化，而NFAT 是一種識別MCT1 啟動子上幾個NFAT 結合序列一致的轉錄因子［10］。因此，運動肌肉中MCT1 表達的控制可能依賴于NFAT 與基因啟動子的結合。當AMP 水平升高時，AMPK 刺激轉錄共激活因子PGC1α，從而上調MCT1 的表達并促進高度氧化的肌纖維的形成，但不會提高MCT2 或MCT4 的表達［12］。在癌癥中，MCT1 的表達被發現，通過基因啟動子區域CpG 島的高甲基化而在人類乳腺癌細胞中被抑制［13］。在癌癥中，MCT1 蛋白的表達也被報道受缺氧的p53 依賴性調控［14］。p53 和MCT1基因啟動子之間的直接相互作用可能降低MCT1 mRNA 的穩定性，對于其他MCT 成員表觀遺傳調控的報道很少。

1.2 MCT 蛋白的結構和轉運底物功能

在結構上，MCT 家族成員共享保守的氨基酸同一性、預測的拓撲結構以及同源性［15］。所有的MCT亞型均有12 個跨膜（TM）結構域與細胞內C 末端和N 末端的存在，TM 螺旋6 和TM 螺旋7 之間有1 個大的細胞溶質環，TM1 和TM5 中有2 個高度保守的序列（圖1）［15］。MCT 家族成員的1 個共同特征是TM區域比loops 和C 末端具有更好的序列保守性，且大多數成員在TM8 中共享1 個帶正電的精氨酸（Arg）殘基，這是轉運活性所必需的，并且可能與底物的帶負電的羧酸基團相互作用［16，17］。盡管MCT 表現出保守的序列基序，但它們的差異表達、調節和可變氨基酸殘基允許每個亞型具有底物特異性和獨特的生理影響。MCT1、MCT2、MCT3 和MCT4 負責一元羧酸在質膜上的雙向質子連接轉運，這些MCT 異構體顯示出對短鏈單羧酸的偏好，包括在位置2 和3 上取代的單羧酸，例如丙酮酸、L-乳酸、D-β-羥基丁酸和乙酰乙酸，它們對不同底物有不同的親和力（表1）。

與其他家族成員相比，MCT1 具有更廣泛的分布和運輸范圍更廣的底物。MCT1 轉運的研究最初集中在乳酸，在包括脂肪生成、糖異生和氧化磷酸化的代謝途徑中，乳酸可用作從細胞外空間攝取的底物。消耗乳酸的細胞可能表達MCT1、MCT2 或兩者，具體取決于組織和物種［18，19］。而在許多具有氧化代謝途徑的癌細胞中，主要表達MCT1，因為它促進了乳酸向細胞內的運輸，從而為TCA 循環和氧化磷酸化提供燃料［20，21］。研究發現，MCT1 對乳酸具有中間親和力（Km乳酸=3.50~10.00 mmol/L），并且在健康和癌癥組織中廣泛表達［22］。MCT2（Km乳酸=0.50~0.75 mmol/L）和MCT3（Km乳酸=5.00~6.00 mmol/L）對乳酸的親和力最高，但其表達僅限于非常特殊的組織［23-25］。這些轉運蛋白轉運丙酮酸的差異更為明顯，MCT1、MCT2 和MCT4 的 丙 酮 酸Km值 分 別 為1.00、0.10 和153.00 mmol/L［15］。MCT1 對β-羥基丁酸鹽和乙酰乙酸的親和力都比MCT2 低，說明MCT2是一種高親和力的轉運蛋白，對于MCT3 只知道其是乳酸轉運蛋白，對于其他底物沒有更詳盡的報道，而MCT4 對底物的轉運親和力都很低，但其轉運容量大，廣泛表達在糖酵解型白肌纖維，人小腸、腎臟和胎盤中［26］。

MCT5 和MCT6 被發現在人類腸道中表達，其中MCT6 已被證明可轉運布美他尼、那格列奈和丙磺舒等藥物的質子連接轉運，且許多糖苷類黃酮可以作為MCT6 的抑制劑［27］。MCT7 參與了肝臟細胞在禁食時以循環脂肪酸為燃料輸出酮體，特別是β-羥基丁酸鹽［28］。因此，在斑馬魚中MCT7 表達的缺失導致肝脂肪變性，而人MCT7 的引入可以阻止肝脂肪變性。另外，MCT8（大鼠亞型）和MCT10（小鼠亞型）分別以不依賴質子和鈉的方式介導甲狀腺激素［29］和芳香族氨基酸［30］的轉運。MCT9 和MCT12 還可運輸單羧酸鹽，包括更疏水的分子，如肉堿和肌酸［31］。分析人類mRNA 表達數據時發現，MCT11 在甲狀腺、唾液腺和肝臟中表達較高［32］。MCT14 在小鼠神經系統中和腎臟中被發現有表達［33］，其他MCT家族成員的底物和功能目前尚不清楚。

2 MCT 蛋白活性的調控蛋白

2.1 跨膜糖蛋白

MCT 蛋白的正確表達、定位和活性取決于與輔助蛋白的相互作用，主要是跨膜糖蛋白Basigin/CD147［34］和Embigin/gp70［35］。這些蛋白質都包含細胞外結構域（EC）、跨膜結構域（TM）和胞內結構域（IC），且EC 域含有的免疫球蛋白域結構的數量不同，同時EC 域還有多個糖基化位點，Basigin 根據剪接變體也會有2 個或3 個免疫球蛋白域［36］。這種糖基化程度取決于不同的組織，相應的功能也有所差異。TM 域高度保守且有帶電荷的谷氨酸殘基和典型的亮氨酸拉鏈結構，有助于輔助蛋白質錨定在質膜上并與細胞內蛋白質相互作用。

一些研究人員已經利用多種不同技術，如免疫共沉淀、免疫熒光、交聯和熒光共振能量轉移證明了輔助蛋白對MCT 定位于質膜上并發揮活性起到了關鍵作用［37-40］。如果沒有它們，MCT 就無法到達最終位置并在高爾基體中積累［35］。與Embigin 相比，Basigin 在組織中更廣泛地表達，并且更頻繁地作為MCT1、MCT3 和MCT4 的優先伴侶出現，在Basigin 敲除小鼠中，MCT1、MCT3 和MCT4 在視網膜色素上皮中不表達從而導致失明［41］，進一步支持Basigin 作為MCT1、MCT3 和MCT4 膜表達伴侶的作用。MCT2 優先與Embigin 相互作用［37］。在沒有Basigin 的時候，MCT1 也會與Embigin 相互作用［42］，Embigin 還沒有被證明是MCT3 和MCT4 的伴侶［43］。

此外，Basigin 調節MCT11 和MCT12 的膜轉運。在MCT11 轉染的HEK293 細胞中，質膜表達受Basi?gin 表達的調節，Basigin 的敲除導致質膜MCT11 顯著減少，且MCT11 和Basigin 的直接相互作用通過共免疫沉淀得到證實［44］。在MCT12 轉染的HEK293細胞中，Basigin 與MCT12 共定位，并利用共免疫沉淀法證明其有相互作用，且當Basigin 敲低后會降低MCT12 的細胞表面表達［45］，表明MCT12 需要Basigin進行細胞表面表達。

除了MCT1-4 外，MCT8 的正確質膜定位和活性不需要這種相互作用，它似乎形成了同型二聚體［46］，而MCT 家族其他成員（MCT5-7，MCT9、10、13和14）還沒有被證明需要Basigin 或Embigin 來促進向質膜的轉運，目前還沒有發現調控其膜轉運的輔助蛋白。

2.2 碳酸酐酶

還有一些其他蛋白質也被認為與MCT 結合，如細胞內的碳酸酐酶Ⅱ（CAII，胞質CA 亞型）被證明能通過其64 位的組氨酸（His）殘基與MCT1 和MCT4C末端的谷氨酸（Glu）殘基簇結合，從而增強轉運蛋白的活性，但不會增強MCT2 的活性［47］；CAIV（胞外CA亞型）［48］和CAIX［49］（胞外CA 亞型）可以通過胞外側的Basigin 和Embigin 的IgI 域與MCT/Basigin 或MCT/Embigin 復合物建立相互作用，增強轉運蛋白的活性。最近的研究探討了碳酸酐酶增強MCT 轉運活性 的機制［50］（圖2）。碳 酸酐酶II 直 接與MCT1 和MCT4 的C 末端結合，轉運體活性增加；然而，它不與MCT2 結合，這與其無法增強MCT2 活性一致。碳酸酐酶IX 通過其帶負電荷的碳酸酐酶IX 蛋白多糖樣結構域來轉移質子，從而增強MCT4 轉運活性。

圖2 碳酸酐酶在MCT1/4 調控中的質子天線效應

2.3 透明質酸受體和乳酸脫氫酶

透明質酸CD44 受體可與肺癌和前列腺癌細胞中的MCT1 和MCT4 相互作用［51］，從而穩定膜蛋白復合物，而且透明質酸和CD44 之間的結構性相互作用也有助于調節MCT 的定位和功能［52］；有報道稱MCT1 在L6 大鼠骨骼肌細胞的線粒體中與LDH 共定位，并在沒有去垢劑的情況下在蛋白質提取物的線粒體部分MCT1 和LDH 共免疫沉淀，表明至少在這些細胞的線粒體水平上，2 種蛋白質之間存在相互作用［53］。同時有研究提出了細胞內乳酸穿梭/乳酸線粒體氧化復合物模型（圖3），指出乳酸脫氫酶使丙酮酸中的乳酸減少，并通過MCT1 進一步導入線粒體間質進行氧化［54］。由于LDHB 和LDHA 對乳酸和丙酮酸具有不同的親和力，而MCT 亞型的Km和Vmax值因底物而異，因此，LDHs 與MCT 的潛在相互作用可能是一種微調跨膜單羧酸轉運方向的機制，然而這種機制還存在爭議。

糖酵解型癌細胞通過葡萄糖轉運蛋白（GLUT）攝取葡萄糖，然后使用糖酵解依次將葡萄糖轉化為丙酮酸和ATP，接著丙酮酸用乳酸脫氫酶A（LDHA）將丙酮酸轉化為乳酸。乳酸與質子一起通過MCT4轉運到細胞外。氧化型癌細胞通過MCT1 攝取乳酸和質子，接著乳酸被乳酸脫氫酶B（LDHB）氧化為丙酮酸，產生副產物NADH，然后丙酮酸和NADH 都進入TCA循環通過氧化磷酸化促進ATP的產生（圖3）。

圖3 基于氧化型癌細胞與糖酵解型癌細胞之間乳酸交換的代謝共生模型

3 MCT 蛋白在腫瘤中的生理特性

3.1 MCT 蛋白在腫瘤與癌癥中的功能

MCT 在腫瘤微環境的代謝穩態中起重要作用，它們確保糖酵解和耐酸表型的維持，從而促進癌細胞的惡性行為。MCT 通過促進乳酸的輸出使糖酵解能夠快速進行，并且它們還通過質子的共轉運參與pH 調節。在腦腫瘤中，細胞間乳酸穿梭為神經元提供燃料，從而破壞正常的細胞代謝相互作用，以維持腫瘤的生存和生長［55］。MCT1 和MCT4 是癌細胞中表達最廣泛的MCT 亞型。MCT1 對乳酸的親和力高，且優先在吸收乳酸的氧化癌細胞中表達［55］。相反，MCT4 對乳酸的親和力低，但周轉率高，特別適合促進糖酵解癌細胞輸出乳酸，其表達因缺氧而上調，此過程受HIF-1α 調節［25］。據報道，MCT1 在多種人類癌癥中表達，包括宮頸鱗癌細胞、結腸癌［20］、胃癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌和前列腺癌［56-60］。其中，MCT1 也被認為是膀胱癌、乳腺癌和卵巢癌中負責乳酸跨膜轉運的最重要亞型［51，60］。MCT4 也廣泛分布于不同的癌癥類型中，如乳腺癌、結腸癌、膀胱癌和前列腺癌，以及在婦科腫瘤和膠質瘤等腫瘤細胞中也有表達［51，58-60］。相對于MCT1 和MCT4，MCT2和MCT3 在癌癥中的研究較少。在非小細胞肺癌、乳腺癌、結腸癌等癌細胞的細胞質中發現了MCT2［51，61］，據報道，MCT3 也在非小細胞肺癌的癌細胞和間質細胞內表達［61］。

除此之外，MCT 也促進腫瘤細胞的遷移和侵襲過程。Izumi 等［62］研究表明，MCT1 和MCT4 的表達與人類肺癌細胞的侵襲相關。有研究結果進一步證明MCT 抑制劑CHC 可以減少膠質瘤細胞的遷移和侵襲［59］；在子宮頸鱗狀癌細胞中，MCT1 可以獨立其轉運蛋白的活性，通過激活NF-κB 轉錄因子來促進腫瘤細胞的侵襲和轉移［63］；高表達的MCT1 可以通過攝取血液循環系統中的乳酸來抵御氧化壓力，使黑色素瘤細胞獲得更強的轉移能力［64］；在前列腺癌和三陰性乳腺癌細胞中，MCT1 通過下調c-Met受體來調節肝細胞生長因子（HGF）介導的上皮間質轉化（EMT），使細胞間黏附力喪失和細胞運動性增強，從而導致腫瘤細胞的侵襲和轉移［65］；MCT4 的抑制和敲除可減少部分胰腺導管腺癌細胞的遷移［66］。在這種情況下，MCT1 和/或MCT4 被認為是癌癥的潛在治療靶點。對于其他MCT 同工型，還不清楚它們與腫瘤發生和發展的相關性。

3.2 MCT 蛋白作為腫瘤的潛在治療靶點

如前所述，單羧酸轉運蛋白與多種癌癥發生以及腫瘤細胞的遷移過程緊密相關，故其可以作為癌癥治療靶點蛋白，抑制單羧酸轉運蛋白活性，則可以達到治療癌癥的目的。已經鑒定出幾種MCT 抑制劑，最早發現的抑制劑是根皮素、類黃酮（如槲皮素）、二苯乙烯二磺酸酯［包括DIDS 和4，4′-二苯甲酰胺二苯乙烯-2，2′-二磺酸酯（DBDS）］和α-氰基-4-羥基肉桂酸鹽（CHC）及其類似物［15］。但沒有一種對給定的MCT 亞型具有特異性，并且大多數對其他蛋白質也具有很高的親和力。特別是CHC 缺乏效力和特異性，其具有抑制線粒體丙酮酸載體（MPC）的能力，因此，線粒體對丙酮酸的攝取比MCT1 更有效［67］，也有其他對MCT 具有高親和力的抑制劑，具體抑制選擇性見表2。

表2 MCT1、MCT2 和MCT4 抑制劑選擇性

AR-C155858 是一種雙重MCT1/2 抑制劑，可通過阻斷乳酸的排出抑制T 淋巴細胞活化，因此具有免疫抑制作用。AR-C155858 在細胞內可以與MCT1 的TM7-10 結合從而抑制MCT1 的活性［68］。有報道指出，在表達內源性MCT1 的大鼠紅細胞中表現出對MCT1 的有效抑制，Ki值為2.3 nmol/L。ARC155858在轉染MCT2的非洲爪蟾卵母細胞的研究中也被報道抑制MCT2，但程度較小（Ki>10 nmol/L）［37］。AR-C155858 對MCT2 的抑制作用具有選擇性，當MCT2 與輔助蛋白質Basigin 蛋白結合時有抑制作用，但當它與優選的伴侶蛋白Embigin 結合時沒有抑制作用［37］。AZD3965 是AR-C155858 的衍生物，也是一種雙重MCT1 和MCT2 抑制劑，可有效抑制腫瘤細胞內乳酸的排出和腫瘤細胞的生長，并且可增加放射敏感性，其對MCT1 的效價比MCT2 高6 倍，并且在10 μmol/L 下對MCT3/MCT4 沒有抑制作用［69］。AZD3965 已被證明能顯著降低MCT1 過度表達的人小細胞肺癌和各種淋巴瘤異種移植模型的細胞和腫瘤生長［62，70，71］。目前正在英國進行針對晚期實體瘤和淋巴瘤的I 期臨床試驗（NCT01791595）［72］，以后可能用于前列腺癌、胃癌和彌漫性大B 細胞淋巴瘤的治療。

新型抑制劑BAY-8002 可以有效抑制乳酸的雙向轉運，顯著增加腫瘤內乳酸水平和瞬時調節丙酮酸水平，從而使腫瘤細胞處于停滯狀態。BAY-8002對MCT1 的選擇性是MCT2 的5 倍，對MCT4 沒有抑制作用。使用放射性標記法研究AZD3965 和BAY-8002 對MCT1 的競爭性抑制，結果表明，這2 種配體具有相似的結合位點，說明其具有相似的作用方式［73］。7-氨基羧基香豆素（7ACC）被開發用于選擇性干擾富含乳酸的腫瘤微環境中的乳酸通量，7ACC2 抑制表達MCT1 和MCT4 的癌細胞中的乳酸內流，但不抑制外流，表明其作用模式不同于ARC155858［74］。表明7ACC 選擇性地影響MCT 轉運體轉位周期的一個部分，導致嚴格抑制乳酸內流。這種獨特的活性與抗腫瘤作用有關，不易產生耐藥性和副作用。

Wang 等［75］解析了野生型（WT）人MCT1/Basi?gin-2 復合物，以及3 種原型MCT 抑制劑AZD3965、BAY-8002 和7ACC2 的冷凍電鏡結構，揭示抑制劑的準確結合位點和抑制機制，其中MCT1-Basigin-2+乳酸的結構呈現向外開放的構象，而與抑制劑結合的3 種構象中，與BAY-8002 和AZD3965 結合的MCT1-Basigin-2 的復合物結構均具有向外開放的構象，而7ACC2 結合MCT1-Basigin-2 的結構則為向內開放狀態（圖4）。盡管如此，所有3 種抑制劑都直接占據底物結合位點，通過與底物結合的直接競爭和對轉運體構象變化的抑制來實現對MCT1 的抑制。這些結果闡明了3 種抗癌候選藥物的作用模式，為以MCT 為靶點的結構導向藥物發現奠定了重要的框架。

圖4 單羧酸轉運體的抑制機制

4 小結與展望

近年來，MCT 家族蛋白在生理和病理條件下所起的作用越來越重要。由于其廣泛的組織分布和底物，MCT 蛋白有可能影響許多內源性化合物和藥物的藥代動力學。盡管近年來對MCT 的研究有所增加，但需要進一步研究闡明14 種MCT 蛋白的功能，以了解這些轉運蛋白在藥物處置和內源性化合物穩態中的作用，以及它們作為疾病潛在靶點的作用。值得注意的是，MCT1 和MCT4 是癌細胞中表達最廣泛的亞型，抑制它們的轉運活性是目前癌癥化療策略的研究領域，例如將MCT1 和MCT4 抑制劑聯合使用，保證腫瘤治療的有效性，而且對于其他MCT 亞型的研究將大大增加目前對單羧酸轉運蛋白家族的認識，相信隨著對MCT 蛋白及其復合物在結構和作用機理等方面研究的不斷深入，人們可以詳細了解MCT 蛋白影響腫瘤細胞的途徑及其作用機制，從而能夠為腫瘤的治療提供更多、更精確的思路和策略。