新化合物LFG-500 誘導人乳腺癌細胞凋亡

王 凡 蔣海靜 李成林 ＊

（1.徐州醫科大學江蘇省新藥研究與臨床藥學重點實驗室，江蘇 徐州 221004；2.徐州醫科大學附屬醫院，江蘇 徐州 221000）

0 引言

乳腺癌是中國女性中最常見的癌癥。 美國2020年癌癥統計數據顯示， 在確診癌癥的女性患者中，排名前三位的癌癥是乳腺癌、肺癌和結直腸癌，共占新確診病例的50%，其中乳腺癌就占了30%。現有的乳腺癌治療方法包括化學治療、放射治療、靶向治療、免疫治療以及術前術后的內分泌治療。 然而，作為一種惡性腫瘤，乳腺癌具有較高的轉移性，手術切除后極易復發，此外，用于化療的臨床藥物毒副作用較大，且腫瘤細胞極易產生耐藥性。 再加上早期篩查診斷方法的缺乏和高昂的治療成本，都使乳腺癌的治療困難重重。 因此，尋找有效的治療乳腺癌的方法是人類需要不斷攻克的難題，而探索高效低毒性的抗癌新藥尤為重要。

目前大部分細胞毒性抗癌藥物都是通過誘導細胞凋亡發揮作用。 凋亡是一種程序性細胞死亡的過程，機體在正常發育過程中可借助凋亡有效的清除一些無用細胞，控制細胞數量。 因此誘導腫瘤細胞凋亡是研究抗腫瘤藥物的一個重要部分。 現代藥理學研究表明，天然黃酮類化合物具有抗菌、降血脂、抗病毒、抗腫瘤等多種藥理作用。 然而，天然黃酮類化合物溶解度差、首過效應明顯、生物利用度極低。 LFG-500（CHNO，見圖1）是利用哌嗪基和芐基取代易于發生代謝的羥基，對黃酮母環進行結構修飾后合成的全新化合物。本課題組前期研究發現LFG-500 具有較好的抗腫瘤侵襲轉移作用， 可抑制人乳腺癌細胞MDA-MB-231 侵襲，具有較好的抗腫瘤活性。 但是LFG-500 能否誘導人乳腺癌MCF-7 細胞凋亡尚未見報道。 因此，本文主要研究黃酮類新化合物LFG-500對乳腺癌細胞生長的抑制作用，初步探討其誘導細胞凋亡作用及可能的機制。 相關工作可為乳腺癌的治療、LFG-500 及黃酮類化合物的抗腫瘤研究與應用提供堅實的實驗基礎。

圖1 LFG-500（C30H32N2O5）分子結構式

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

LFG-500 （中國藥科大學江蘇省腫瘤發生與干預重點實驗室）； 人乳腺癌MCF-7 細胞株 （上海細胞庫）；1640 培養基、胎牛血清（美國Gibco 公司）；活性氧檢測試劑盒、SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液、SDSPAGE 凝膠配制試劑盒、Western 一抗稀釋液、Western二抗稀釋液 （碧云天生物技術研究所）； 胰蛋白酶、MTT、DAPI、Bovine serum albumin（美國Sigma 公司）；Annexin V/propidium iodide（PI）凋亡檢測試劑盒、JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒（凱基生物有限公司）; BCA蛋白濃度測定試劑盒 （美國Thermo Scientific 公司）；PARP、pro-caspase-3/cleaved-caspase-3、pro-caspase-9/cleaved-caspase-9、Bcl-2/Bax 抗體 （美國CST 公司）；酶標儀（美國BioTek 公司）；恒溫CO培養箱（美國Thermo Scientific 公司）；超凈工作臺（蘇凈集團空氣技術公司）； 倒置熒光顯微鏡 （日本OLYMPUS 公司）；Tanon 垂直電泳系統（上海天能科技有限公司）；流式細胞儀（德國Miltenyi 公司）。

1.2 細胞培養

MCF-7 細胞接種于含10%FBS 和1%青霉素-鏈霉素溶液的1640 培養基中， 于37℃、5%CO恒溫培養箱中培養。 當細胞狀態良好，細胞密度達到90%時傳代。

1.3 MTT 法

將MCF-7 細胞消化重懸， 按10個/孔加入96 孔板中，培養箱培養24 h，給予不同濃度的LFG-500 繼續培養24 h。每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL）培養4h，取出96 孔板，棄去上清并加入100 μL/孔的DMSO 以溶解沉淀物，最后使用酶標儀于490 nm 處檢測其吸光度。 細胞活力的抑制率計算公式：

抑制率（%）=（A-A）/A×100%。

1.4 Annexin V-FITC/PI 雙染細胞凋亡檢測實驗

取對數生長期的細胞，以0.25%胰酶-EDTA 消化，配制成10個/mL 的單細胞懸液，接種于24 孔板中，每孔接種4×10個細胞，于培養箱中培養，細胞貼壁后，將培養基替換為LFG-500 濃度為10 μM、20 μM、30 μM的1640 培養基，作用24 h。 根據試劑盒說明書，懸浮細胞200 g 離心5 min，收集；貼壁細胞用不含EDTA的胰酶消化收集。 用PBS 洗滌細胞2 次，200 g 離心5 min，收集細胞。 加入500 μL 的Binding Buffer 懸浮細胞，混勻后加入5 μL Annexin V-FITC，混勻后加入5 μl PI，混勻。室溫、避光、反應15 min。1h 內使用流式細胞儀進行檢測。

1.5 細胞線粒體膜電位檢測

取對數生長期的細胞， 以0.25%胰酶-EDTA 消化， 配制成105 個/ml 的單細胞懸液， 接種于6 孔板中，每孔加入2 ml，于培養箱中培養。 細胞貼壁后，將培養基替換為LFG-500 濃度為10 μM、20 μM、30 μM的1640 培養基，作用24 h。收集懸浮細胞，貼壁細胞消化后收集，與收集的懸浮細胞合并，用PBS 洗滌細胞2 次，200 g 離心5 min。 取500 μL 用去離子水稀釋的預熱至37℃的1×Incubation Buffer，加入1 μL JC-1 染料，渦旋混勻配成JC-1 工作液。 取500 μL JC-1 工作液將細胞均勻懸浮，培養箱中孵育20 min。 室溫離心200 g，5 min， 收集細胞，1×Incubation Buffer 洗2 次。吸取500 μL 1×Incubation Buffer 重新懸浮細胞，使用流式細胞儀進行檢測。

1.6 細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平檢測

分組及給藥同1.5。 收集懸浮細胞，并消化收集貼壁細胞， 合并。 按照1∶1000 用無血清的培養基稀釋DCFH-DA 染料，使終濃度為10 μM。 每組加入1 mL稀釋好的DCFH-DA 染料，在細胞培養箱內孵育20 min。用無血清細胞培養液洗滌細胞3 次，以充分去除未進入細胞的DCFH-DA。最后加入500 μL 的無血清培養基，吹打均勻后，使用流式細胞儀檢測。

1.7 Western blot 法檢測蛋白相對表達水平

分組及給藥同1.5。 消化收集細胞，加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液充分裂解后，按BCA 蛋白測定試劑盒說明書測定樣本中蛋白濃度。 同時測定樣品的光密度值，計算蛋白含量，用裂解液將各樣品調至相同濃度，加入5×上樣緩沖液混合均勻，沸水10 min，使蛋白變性。變性后的蛋白樣品于-20°C 儲存。樣本采用10%～15% SDS-PAGE 進行分離， 將分離的蛋白轉移至硝酸纖維膜上，恒壓20 V，轉膜30 min。將膜用洗膜液洗滌3 次后， 轉移至含有封閉液的表面皿中，在脫色搖床上搖動封閉1 h，加入對應的一抗4℃孵育過夜。 次日用洗膜液清洗3 次后，加入對應的二抗室溫避光孵育2 h，洗膜液清洗3 次。 隨后使用Odyssey 掃描儀掃描， 保存所得圖像用Image J 軟件進行灰度分析，以目的蛋白與內參蛋白光密度的比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.8 統計學分析

數據采用SPSS 16.0 統計軟件處理，數據以均數±標準誤（Mean±SEM）表示，數據符合方差齊性的采用單因素方差分析（one-way ANOVA），多組間比較LSD檢驗； 若數據不符合方差齊性， 則采用Dunnett’s T3檢驗。 假設檢驗水準按α=0.05 判定。 *P＜0.05、**P＜0.01 表示差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 LFG-500 抑制人乳腺癌MCF-7 細胞活力

采用MTT 實驗考察不同濃度的LFG-500 對MCF-7 細胞生長的抑制作用。 結果顯示， 給予不同濃度的LFG-500 處理MCF-7 細胞24 h 后，LFG-500 對細胞活力的抑制作用隨著濃度的升高而逐漸增強（見圖2），其IC50 值為34.07±5.81 μM。依據MTT 實驗結果，選取10 μM、20 μM 和30 μM 的劑量開展后續研究。

圖2 LFG-500 對MCF-7 細胞活力的影響

2.2 LFG-500 對MCF-7 細胞形態的影響

用不同濃度的LFG-500 處理MCF-7 細胞24 h后， 于倒置顯微鏡下觀察細胞形態的變化。 如圖3 所示，對照組細胞貼壁生長，細胞輪廓清楚，細胞間結構緊密，細胞生長旺盛；而隨著LFG-500 劑量的增加，細胞生長受到抑制，細胞變得分散，部分細胞變圓、漂浮。

圖3 不同濃度LFG-500 處理MCF-7 細胞24h 的細胞形態（200×）

2.3 LFG-500 誘導MCF-7 細胞發生凋亡

采用Annexin V-FITC/PI 雙染試劑盒， 利用流式細胞儀分析LFG-500 對MCF-7 細胞凋亡的誘導作用。結果如圖4 所示，LFG-500 處理MCF-7 細胞24 h后，高劑量組凋亡率達到40.27±3.57%，與對照組相比具有統計學差異（**P＜0.01）。上述結果表明，LFG-500可誘導人乳腺癌MCF-7 細胞凋亡，繼而抑制其生長。

圖4 不同濃度LFG-500 處理MCF-7 細胞24h 的細胞凋亡率

2.4 LFG-500 降低MCF-7 細胞線粒體膜電位水平

JC-1 流式細胞術檢測結果如圖5 所示，與對照組相比，10 μM、20 μM 和30 μM LFG-500 組線粒體膜電位分別降 低了22.33±4.77%、28.85±6.40%、53.52±16.38%， 提示LFG-500 可能通過降低細胞線粒體膜電位，繼而激活線粒體凋亡通路誘導細胞凋亡。

圖5 不同濃度LFG-500 對MCF-7 細胞線粒體膜電位的影響

2.5 LFG-500 誘導MCF-7 細胞內ROS 水平升高

ROS 水平檢測結果如圖6 所示， 與對照組相比，LFG-500 處理MCF-7 細胞24 h， 中高劑量組細胞內ROS 水平顯著增高，且該作用具有劑量依賴性。 上述結果提示，LFG-500 促進MCF-7 細胞內ROS 蓄積。

圖6 不同濃度LFG-500 對MCF-7 細胞內ROS水平的影響

2.6 LFG-500 對MCF-7 細胞中線粒體凋亡途徑相關蛋白的影響

Western blot 實驗結果，由圖7 可以看出，與對照組相比，LFG-500 給藥組隨著劑量增大，Bcl-2 蛋白表達逐漸減少，Bax 蛋白表達逐漸增多。 同時，由圖8 可以看出， 細胞中pro-caspase-9 和pro-caspase-3 的蛋白水平顯著降低， 而cleaved caspase-9 和cleaved caspase-3 蛋白水平明顯升高， 說明pro-caspase-9 和pro-caspase-3 分別被LFG-500 活化。 且與對照組相比，LFG-500 可顯著降低PARP 的原型表達水平。

圖7 不同濃度LFG-500 對MCF-7 細胞中Bax 和Bcl-2 蛋白表達水平的影響

3 討論

腫瘤細胞的無限增殖是惡性腫瘤的十大特征之一，而凋亡失調是導致腫瘤細胞無限增殖的重要因素。 細胞凋亡又稱程序性的細胞死亡，是指細胞受到某種刺激或接收到某種信號后為了維持機體內環境穩定而發生的由基因調控的細胞自主有序的死亡過程。 細胞凋亡具有獨特的形態特征和生化特征， 包括細胞皺縮、細胞膜出芽、染色質凝聚、核仁碎裂、DNA 片段化，接著形成凋亡小體被周圍的巨噬細胞吞噬，最后被溶酶體溶解。 腫瘤細胞凋亡在抑制腫瘤發生、發展過程中發揮重要作用。 因此，誘導腫瘤細胞凋亡，并闡明其可能的機制對于尋找新的抗癌藥物具有重要的意義。本研究發現，黃酮類新化合物LFG-500 可顯著抑制人乳腺癌MCF-7 細胞生長，并呈劑量依賴性（見圖2）。光鏡觀察和Annexin V-FITC/PI 雙染結果都表明，LFG-500 能誘導人乳腺癌細胞MCF-7 發生凋亡 （見圖3、圖4），這提示LFG-500 對細胞生長的抑制作用可能與其誘導細胞凋亡有關。

細胞凋亡包括外源性死亡受體通路和內源性線粒體凋亡通路。 在線粒體凋亡通路中，當細胞受到內部凋亡因子的刺激時，如癌基因激活的DNA 損傷、細胞缺氧以及細胞生長因子的缺失，會導致線粒體膜電位降低， 膜通透性增加， 從而使促凋亡因子Cyt C 和AIF 釋放到細胞質中。Cyt C 在細胞內會結合Apaf-1（apoptotic protease activating factor-1） 形成凋亡復合物，繼而激活pro-caspase-9 以及下游的pro-caspase-3，pro-caspase-3 被激活后會分解底物，如PARP，最終導致凋亡的發生。因此，本研究在明確LFG-500 誘導MCF-7 細胞凋亡的基礎上， 考察LFG-500 誘導細胞凋亡是否與調控線粒體凋亡通路相關。 結果顯示，LFG-500 可降低線粒體膜電位（見圖5），可抑制procaspase-9 和pro-caspase-3 的 表 達， 促 進cleaved caspase-9 和cleaved caspase-3 的蛋白表達，同時下調PARP 的蛋白表達 （見圖8）。 說明LFG-500 可刺激MCF-7 細胞，活化pro-caspase-9 和pro-caspase-3，繼而促進PARP 切割，激活線粒體凋亡通路。

圖8 不同濃度LFG-500 對MCF-7 細胞中PARP及caspase 相關蛋白表達水平的影響

ROS 參與多種生物學進程，在細胞信號、生物合成過程和宿主防御方面都發揮重要作用。 在腫瘤細胞內，ROS 水平的升高和降低作為一種輕度氧化應激反應，參與多種致癌途徑的激活。 但是，持續的ROS 蓄積，特別是ROS 自由基的蓄積，會對DNA、脂質和蛋白質造成損傷，影響細胞正常生長。ROS 水平升高， 會刺激線粒體膜電位降低， 促使線粒體將ROS 釋放至細胞質中，引起過度氧化應激反應，而這種過度氧化應激反應又會刺激周圍線粒體釋放更多的ROS，最終導致細胞死亡。 此外，Bcl-2 蛋白家族也參與到線粒體凋亡通路中，Bax/Bcl-2 的比例決定了細胞內線粒體凋亡通路是否被激活。 通過實驗發現，MCF-7 細胞經過LFG-500 處理后，細胞內ROS 水平明顯升高（見圖6），同時，LFG-500 可上調促凋亡蛋白Bax 的表達，下調抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達，即增加Bax/Bcl-2 的比值（見圖8）。 提示LFG-500 可能是通過促進細胞內ROS 積聚、線粒體膜電位擴散，激活線粒體凋亡通路，誘導細胞凋亡，發揮抑制MCF-7 細胞生長的作用。

4 結語

綜合以上研究結果可知， 當MCF-7 細胞受到LFG-500 干預后，引起細胞內ROS 水平顯著升高，過量的ROS 誘導MCF-7 細胞線粒體膜電位降低， 激活了線粒體凋亡通路， 最終導致細胞凋亡。 本實驗為LFG-500 的抗癌作用研究提供了理論基礎，希望能為乳腺癌藥物治療提供新的思路。