苗藥五香血藤提取物對CIA大鼠血清VEGF、ASIC3表達的影響

寧燕 羅康華 蔣催蓉 黨榮敏 葉勁松 劉運麟

(1黔南民族醫學高等專科學校，貴州 都勻 558013;2黔南州人民醫院病理科)

類風濕性關節炎(RA)是一種以侵蝕性關節炎為主要表現的全身性自身免疫性疾病〔1〕，RA在全球的平均發病率為1%，我國的發病率為0.2%～0.5%，患者的臨床表現多為受累關節腫脹、疼痛及功能下降，如果不進行及時有效的治療，約50%的患者在2年內會出現不同程度的關節畸形和功能受損，嚴重影響患者的生活質量〔2,3〕。RA發病機制十分復雜，研究發現〔4,5〕，血管內皮生長因子(VEGF)、三型酸敏感離子通道(ASIC3)參與了RA炎癥、疼痛等過程，并在其中發揮重要作用。目前，RA治療藥物主要是糖皮質激素(GCs)、非甾體抗炎藥(NASDs)等，但該類藥物能夠引起不良反應，對心血管造成一定風險〔6〕。隨著RA治療藥物的不斷研發，中醫藥以其副作用小，療效好等特點展現了巨大的挖掘潛力。五香血藤〔7〕是貴州特色苗藥，具有治療關節炎、跌打損傷等骨科疾病等作用，然而，有關五香血藤治療關節炎的動物實驗研究未見報道，為此，本研究以膠原誘導關節炎(CIA)大鼠為模型，進一步探索苗藥五香血藤提取物對VEGF、ASIC3表達的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物與分組 成年SD大鼠60只，雌雄各30只，體重230～250 g，購自第三軍醫大學實驗動物中心。將大鼠隨機分為6組，空白對照組(正常組)，模型對照組(模型組)，地塞米松對照組(陽性藥物組)，五香血藤提取物低、中、高劑量組，每組10只，雌雄各半，分籠喂養，每籠5只，自由取食，適應性飼養3 d。

1.1.2藥物 五香血藤購自貴州都勻市中藥材市場，并由廣西師范大學化學與藥學學院進行鑒定和質控，15 kg干五香血藤，粉碎，加入萃取釜中，用80 L 80%的乙醇萃取3次，得到浸膏1 200 g，將浸膏配制成10 mg/ml濃度的儲備液備用。醋酸地塞米松片，辰欣藥業股份有限公司，批號：國藥準字H37021898；牛Ⅱ型膠原，美國Chondrex公司提供，批號：20022；完全弗氏佐劑(IFA)，美國Sigma公司提供，批號：20080301。

1.1.3主要試劑與儀器 大鼠血清VEGF及ASIC3酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購置武漢基因美科技有限公司；全自動酶標儀,型號：Victor X3，由美國Perkin Elmer公司提供。

1.2方法

1.2.1CIA大鼠模型制備 依據文獻〔8,9〕，取2 mg/ml牛Ⅱ型膠原乙酸溶液與等體積完全弗氏佐劑配成1 mg/ml膠原乳劑備用。將0.2 ml膠原乳劑注入每只大鼠的右后足及背皮內，1 w后，采用同樣的方法進行第2次免疫，每只大鼠的右后足及背皮內注射劑量為0.1 ml。第2次免疫后開始計算各實驗組大鼠關節炎癥指數(AI)，AI為4個關節腫脹評分總和，AI≥4即為造模成功。

1.2.2CIA炎癥評分標準 大鼠的每個爪子最高評為4分，每只大鼠最高評為16分，AI具體標準如下〔10〕:0分=無關節紅腫；1分=關節輕度紅腫；2分=關節中度紅腫；3分=關節重度紅腫；4分=關節畸形或不能負重。

1.2.3足腫脹測量及計算 足腫脹度=造模后足趾厚度-造模前足趾厚度〔11〕，分別在造模前和給藥后的第7、14、21、28天，使用游標卡尺對各組大鼠右后足趾進行足趾厚度測量,并進行炎癥評分，直至給藥結束。

1.2.4給藥方案 第1次免疫14 d后，AI≥4分，造模成功，1 d后開始給藥。藥物劑量參考文獻〔12〕進行確定，陽性藥物組給予醋酸地塞米松灌胃，劑量，0.35 mg/kg；五香血藤提取物低、中、高劑量組灌胃劑量分別為63、126、252 mg/kg；模型組與正常組給予灌胃同體積的蒸餾水；各組大鼠給藥次數為1次/d，連續給藥28 d。

1.2.5取材與組織處理 于末次給藥結束后2 h對大鼠進行相應處理。先稱取各組大鼠體重并記錄，后股動脈取血處死大鼠：①取股動脈血，靜置，離心，取上清液，在-20℃下保存待測。采用ELISA測定大鼠血清VEGF、ASIC3水平，操作嚴格按照試劑盒說明書進行；②取大鼠雙踝關節及足爪，分離去除周圍軟組織及肌肉組織，放入4%的多聚甲醛固定，脫鈣、水化、蘇木素-伊紅(HE)染色、透明、固定后，光鏡下觀察病理變化。

1.2.6測定臟器指數 待大鼠處死后，解剖取胸腺、脾臟等器官，濾紙吸干，稱重，記錄數據備用。臟器指數=臟器重量/體重×100%。

1.3統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析及多重比較。

2 結 果

2.1各組右后足腫脹度比較 與正常組比較，各實驗組足腫脹度較為明顯(P<0.05)，給藥不同時間，各藥物組大鼠足腫脹度與模型組比較，均顯著好轉(P<0.05)，第14、21、28天，五香血藤提取物高劑量組與陽性藥物組足腫脹度差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

2.2各組關節總AI比較 模型組及各給藥組第7、14、21、28天關節各AI顯著高于正常組(P<0.05)。與模型組比較，陽性藥物組及五香血藤提取物高劑量組第7、14、21、28天關節總AI顯著降低(P<0.05)，五香血藤提取物低劑量組第14、28天及五香血藤提取物中劑量組第14、21、28天關節總AI顯著降低(P<0.05)。在給藥的第21天和28天，五香血藤提取物高劑量組與陽性藥物組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表1 各組給藥不同時間右后足腫脹度比較

表2 各組給藥不同時間關節總AI比較分)

2.3各組血清VEGF、ASIC3水平比較 第28天給藥結束后，與正常組比較，各實驗組血清VEGF、ASIC3表達差異具有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，各藥物組VEGF、ASIC3表達顯著降低(P<0.05)；陽性藥物組與五香血藤提取物高劑量組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 各組血清VEGF、ASIC3水平比較

2.4各組臟器指數比較 與模型組比較，各給藥組脾臟、胸腺指數差異顯著(P<0.05)，與陽性藥物組比較，五香血藤提取物中、高劑量組脾臟和胸腺指數差異不具有統計學意義(P>0.05)，見表4。

2.5各組關節病理觀察 正常組踝關節滑膜組織光滑完整，組織結構正常,滑膜細胞、軟骨及骨組織中未見炎癥細胞浸潤及血管增生；模型組大鼠踝關節滑膜組織排列紊亂、增生明顯，軟骨組織破壞明顯，在軟骨面，還可見部分軟骨細胞增生，周圍組織中大量炎癥細胞浸潤，且組織水腫嚴重；五香血藤提取物低劑量組大鼠踝關節滑膜組織仍有較多炎癥細胞浸潤，但其浸潤及組織水腫現象較模型組有所減輕；五香血藤提取物中劑量組大鼠踝關節滑膜組織及周圍組織內可見炎癥細胞數量減少，組織輕度水腫，其間少量新生血管及滑膜增生，軟骨輕度增生，少數關節軟骨破壞；五香血藤提取物高劑量組和陽性藥物組大鼠踝關節均可見明顯新生血管，滑膜組織病理狀況明顯改善，滑膜組織及周圍組織內水腫明顯緩解，僅可見少量的炎癥細胞浸潤，沒有明顯的軟骨及骨組織的破壞，見圖1。

表4 各組臟器指數比較

圖1 各組踝關節病理(HE染色,×100)

3 討 論

RA是一種慢性炎癥反應，近年來，有關RA中藥治療的研究逐漸成為RA藥物研發的熱點。2015年，國務院辦公廳發布《國務院辦公廳關于印發中醫藥健康服務發展規劃(2015-2020年)的通知》〔13〕，將中醫藥服務醫療、服務健康產業發展上升至國家發展層面，進一步深化醫藥衛生改革，促進全面健康。五香血藤為木蘭植物長梗五味子的莖藤，是貴州常用的民間草藥，具有活血消腫、理氣止痛等功效，其主要活性成分為木脂素，具有抗腫瘤、抗氧化、安定等藥理作用〔14〕。本研究結果表明，就CIA大鼠足關節外部形態而言，五香血藤提取物發揮了消除腫脹的作用。

VEGF是一種高度特異性的促血管內皮細胞生長因子，就目前研究得知為最強血管通透劑，能夠促使內皮細胞分化和增生，使血管通透性增強，誘導血管翳的生成〔4，15〕。VEGF與RA關系研究認為〔16，17〕，VEGF對關節滑膜血管翳的形成具有特殊的影響作用，通過調控血管內皮細胞的增殖，形成新微生血管，使血管內物質滲出增加，血管通透性增強，進而導致炎癥的進一步發展。劉春芳等〔18〕對風濕祛痛膠囊對CIA大鼠滑膜血管新生的影響進行研究，結果發現，CIA大鼠關節滑膜中VEGF含量明顯增加，VEGF含量與CIA大鼠關節炎癥呈正相關。本研究結果提示，五香血藤提取物能夠對CIA大鼠關節的炎癥因子發揮抑制作用。

ASICs是一類胞外H+激活的陽離子通道，屬于阿米洛利敏感的上皮鈉通道/退變素，超家族中的一員，在周圍和中樞神經系統中具有廣泛分布，與RA關系密切〔19〕。已研究發現〔20，21〕，ASICs能夠促進RA關節組織中白細胞介素(IL)-1β等炎癥細胞的分泌，參與組織酸化調控。其中3型，ASIC3在痛覺傳導通路上廣泛存在，在炎癥環境中痛覺敏感形成發揮重要的生物學作用，是主要的酸感受器〔22〕。季慶輝等〔23〕對ASIC3 在膝關節骨性關節炎大鼠疼痛中的作用進行研究，結果發現，ASIC3與膝關節骨性關節炎大鼠繼發性疼痛呈正相關。

胸腺和脾臟是機體的重要免疫器官，胸腺、脾臟指數能夠在一定程度上反映出機體的免疫水平〔24〕。胸腺能夠產生胸腺細胞，胸腺細胞能夠作為T淋巴細胞的后備細胞，以備T細胞不足之需，協助機體完成免疫調控。脾臟作為機體重要的淋巴器官，能夠對有害微生物、腫瘤細胞等進行過濾，是機體特異性免疫反應的重要場所。本研究表明，五香血藤提取物能夠對CIA大鼠發揮抗炎作用。

綜上所述，高劑量五香血藤提取物能夠通過抑制VEGF和ASIC3的表達，對CIA大鼠發揮較好的治療作用，但RA發病機制尚未明確，五香血藤對其治療作用機制還有待進一步挖掘。