LINC00189激活PI3K/Akt信號通路對Dex作用的成骨細胞凋亡和分化的影響

徐梅玲 張育珠 申大年

(1青海省第五人民醫院疼痛科，青海 西寧 810000；2西寧市第一人民醫院疼痛科；3青海省第五人民醫院泌尿科)

骨質疏松是一種常見的與年齡相關的退行性疾病，其主要特征表現為骨組織的顯微結構退行性改變和骨密度降低。骨質疏松可引起骨脆性增加，骨強度降低，易發生骨折〔1〕。骨質疏松的核心發病機制是雌激素下降導致的成骨細胞骨形成能力降低和破骨細胞骨吸收增強，即骨重建和骨吸收失衡〔2〕。成骨細胞是骨形成的主要細胞，參與骨組織的代謝平衡、生長發育及損傷修復。在骨形成過程中，成骨細胞經歷骨增殖、分化和凋亡3個階段，其增殖、分化和凋亡的異常在骨質疏松發生發展中起重要作用〔3〕。因此，研究調控成骨細胞增殖、分化和凋亡的分子機制，發現具有促成骨作用的藥物治療靶點，將為骨質疏松治療提供新途徑。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類小分子非編碼RNA，參與調控細胞的增殖、分化和凋亡等生命學過程，與人類多種疾病的發生發展密切相關〔4～6〕。有報道稱，LINC00189在絕經后骨質疏松腎陰虛證婦女外周血單個核細胞中表達降低，可能參與骨質疏松的發生發展過程〔7〕。但LINC00189對成骨細胞凋亡和分化的影響還未見相關報道。本研究旨在探討LINC00189對地塞米松(Dex)作用的成骨細胞凋亡和分化的影響及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料 小鼠成骨細胞系MC3T3-E1購自中國科學院上海細胞庫；胎牛血清(FBS)購自美國Hycolne公司；α-MEM培養基、LipofectamineTM2000試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒和膜聯蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)細胞凋亡試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司；Dex購自浙江仙琚制藥股份有限公司；胰蛋白酶、p-磷酯酰肌醇3-激酶(PI3K)/p-蛋白激酶B(Akt)信號通路抑制劑LY294002均購自美國Sigma公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒和聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司；PCR引物購自上海生工生物工程有限公司；酶切半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cleaved-caspase)3、p-PI3K、p-Akt和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體均購自美國Santa Cruz公司；LINC00189過表達載體(pcDNA-LINC00189)和空載體(pcDNA)購自上海吉瑪制藥技術有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養和轉染 MC3T3-E1細胞用含10% FBS的α-MEM培養基培養。培養箱環境：溫度37℃，5%CO2，濕度97%。及時更換培養基，當細胞融合至80%左右時，吸棄培養基，適量預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細胞。吸棄PBS后，加入0.25%胰蛋白酶消化，進行傳代培養。取對數生長期的MC3T3-E1細胞，以每孔1×105個細胞接種于6孔板中，當細胞融合至60%時，更換不含FBS的α-MEM培養基。分別將LINC00189過表達載體(pcDNA-LINC00189)、空載體(pcDNA)轉染至MC3T3-E1細胞，具體轉染過程參照LipofectamineTM2000試劑盒說明書。轉染6 h后，更換含10%FBS的α-MEM培養基。繼續培養48 h后，收集細胞用于后續實驗。

1.2.2細胞分組處理 細胞以每孔2.5×104個接種于6孔板中。未進行轉染的細胞分為對照組、模型組和LY294002組。對照組細胞正常培養24 h；模型組細胞用含10 μmol/L〔8〕Dex的培養基干預24 h；LY294002組細胞用含10 μmol/L〔9〕LY294002的培養基預處理20 min后，再加入10 μmol/L Dex共同干預24 h。轉染pcDNA3.1、pcDNA3.1-LINC00189的細胞用含10 μmol/L Dex的培養基干預24 h，記為pcDNA3.1組和pcDNA3.1-LINC00189組。轉染pcDNA3.1-LINC00189的細胞用含10 μmol/L的LY294002的培養基預處理20 min后，再加入10 μmol/L Dex共同干預24 h，記為LY294002+pcDNA3.1-LINC00189組。每組設置3個復孔。

1.2.3實時熒光定量-PCR(RT-qPCR)檢測LINC00189、OCN和OPN的mRNA表達 各組細胞培養后，吸棄培養基，0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞。Trizol試劑提取各組細胞中總RNA，核酸分析儀檢測RNA的純度和濃度。參照逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA。然后以cDNA為模板，進行PCR擴增。擴增程序：95℃預變性5 min，95℃變性10 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共進行35個循環。引物序列LINC00189正向引物5′-CTTTGTCGCCCAGGTTTGTT-3′，反向引物5′-AAAATTAGCCGGGTGTGGTG-3′；骨鈣素(OCN)正向引物5′-GTGGAGGGTTCATCAGCAAC-3′，反向引物5′-AGTATGTCCTTCGTCCTGCC-3′；骨橋連接素(OPN)正向引物5′-TACCCTCCCGAGTAAGTCCA-3′，反向引物5′-CTCGGCCATCATTTGTGCTT-3′；GAPDH正向引物5′-GGTCTCCTCTGACTTCACA，反向引物5′-GTGAGGGTCTCTCTCTTCCT-3′。以GAPDH為內參，2-ΔΔCt法計算細胞中LINC00189、OCN和OPN的mRNA的相對表達水平。

1.2.4流式細胞儀檢測細胞凋亡 各組細胞培養后，吸棄培養基，0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞。PBS清洗細胞。參照Annexin V-FITC/PI試劑和操作說明，取1.0×106個細胞，加入500 μl結合緩沖液，重懸細胞。加入10 μl Annexin V-FITC，室溫避光孵育10 min。加入5 μl PI，室溫避光孵育5 min，流式細胞儀檢測。

1.2.5Western印跡檢測細胞中cleaved-caspase3、p-PI3K和p-Akt蛋白表達 各組細胞培養后，吸棄培養基，0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞。PBS清洗細胞。放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解液提取細胞中總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)蛋白試劑盒測定蛋白濃度。取適量蛋白，100℃煮沸5 min。以每孔30 μg蛋白行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳后，將分離的蛋白濕轉至聚偏氟乙烯膜，于5%脫脂奶粉中封閉，時間1 h。分別加入cleaved-caspase3(1∶1 000)、p-PI3K(1∶800)、p-Akt(1∶800)和GAPDH(1∶1 000)一抗，4℃孵育過夜。加入辣根過氧化酶標記的IgG(1∶5 000)，37℃孵育1 h。加入化學發光試劑避光顯影，凝膠成像系統曝光拍照。

1.3統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1LINC00189在Dex作用的MC3T3-E1中的表達 與對照組LINCOO189水平(0.96±0.06)比較，模型組(0.21±0.02)顯著降低(P<0.05)。與pcDNA3.1組LINC00189水平(0.21±0.02)比較，pcDNA3.1-LINC00189組(0.77±0.05)顯著升高(P<0.05)。

2.2LINC00189對Dex作用的MC3T3-E1凋亡的影響 與對照組比較，模型組細胞凋亡率和cleaved-caspase3蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。與模型組和pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-LINC00189組細胞凋亡率和cleaved-caspase3蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖1、圖2、表1。

圖1 LINC00189對Dex作用的MC3T3-E1凋亡的影響

1～4:對照組，模型組，pcDNA3.1組，pcDNA3.1-LINC00189組圖2 Western印跡檢測cleaved-caspase3蛋白表達

表1 LINC00189對Dex作用的MC3T3-E1凋亡和cleaved-caspase3蛋白表達的影響

2.3LINC00189對Dex作用的MC3T3-E1分化的影響 與對照組比較，模型組細胞中OCN和OPN 的mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)。與模型組和pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-LINC00189組細胞中OCN和OPN 的mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)。見表2。

2.4LINC00189對Dex作用的MC3T3-E1中PI3K/Akt的影響 與對照組比較，模型組細胞中p-PI3K和p-Akt的蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。與模型組和pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-LINC00189組細胞中p-PI3K和p-Akt的蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。見圖3、表3。

表2 LINC00189對Dex作用的MC3T3-E1中OCN和OPN的mRNA表達的影響

1～4：對照組，模型組，pcDNA3.1組，pcDNA3.1-LINC00189組圖3 Western印跡檢測p-PI3K、p-Akt蛋白的表達

表3 LINC00189對Dex作用的MC3T3-E1中PI3K/Akt信號通路的影響

2.5LY294002對Dex處理的MC3T3-E1凋亡的影響 與模型組比較，LY294002組細胞凋亡率和cleaved-caspase3蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。與LY294002組比較，LY294002+pcDNA3.1-LIN-C00189組細胞凋亡率和cleaved-caspase3蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。與pcDNA3.1-LINC00189組比較，LY294002+pcDNA3.1-LINC00189組細胞凋亡率和cleaved-caspase3蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。見圖4、圖5、表4。

圖4 LY294002對Dex處理的MC3T3-E1凋亡的影響

1～4：模型組，LY294002組，pcDNA3.1-LINC00189組，LY294002+pcDNA3.1-LINC00189組圖5 Western印跡檢測cleaved-caspase3蛋白表達

表4 LY294002對Dex處理的MC3T3-E1凋亡和Cleaved-caspase3蛋白表達的影響

2.6LY294002對Dex處理的MC3T3-E1分化的影響 與模型組比較，LY294002組細胞中OCN和OPN 的mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)。與LY294002組比較，LY294002+pcDNA3.1-LINC00189組細胞中OCN和OPN 的mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)。與pcDNA3.1-LINC00189組比較，LY29 4002+pcDNA3.1-LINC00189組細胞中OCN和OPN 的mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)。見表5。

表5 LY294002對Dex處理的MC3T3-E1中OCN和OPN的mRNA表達的影響

3 討 論

隨著我國人口老齡化的加劇，骨質疏松發病率逐年升高〔10〕，嚴重威脅老年人尤其是老年女性的生活質量。成骨細胞的功能恢復和數量維持是目前骨質疏松治療的研究重點。lncRNA長度超過200個核苷酸，在真核生物中廣泛存在。研究顯示，lncRNA在骨質疏松的發生發展中發揮重要作用〔11〕。研究表明，下調lncRNA KCNQ1OT1通過調控miR-701-3p/FGFR3軸是抑制成骨細胞增殖，并促進成骨細胞凋亡〔12〕。lncRNA Rhno1過表達通過調控miR-6979-5p/BMP2軸促進成骨細胞分化，為骨折愈合提供了新的治療途徑〔13〕。

成骨細胞是參與骨形成的關鍵細胞，在骨骼發育過程中分化產生骨基質，負責骨基質的合成、分泌和礦化〔14〕。骨質疏松的發病過程中伴隨著成骨細胞的大量凋亡，骨形成減少，抑制成骨細胞的凋亡有助于促進骨形成〔15〕。細胞凋亡是一種程序性死亡過程，受多種基因的調控。caspase家族在誘導細胞凋亡的分子機制中發揮重要作用，caspase3是該家族的關鍵蛋白酶，其被激活后，裂解相應的底物，誘導細胞凋亡，被稱為凋亡的執行者〔16〕。本研究結果表明Dex通過激活caspase3介導細胞凋亡過程促進MC3T3-E1細胞凋亡，過表達LINC00189可減輕Dex誘導的MC3T3-E1細胞凋亡。

成骨細胞分化是介導骨形成和骨折愈合的重要過程。OCN和OPN是成骨的關鍵指標，可反映成骨細胞的活性〔17〕。OPN主要存在骨組織和牙齒中，可由成骨細胞分泌，參與骨改建、吸收和礦化〔18〕。OCN是骨礦化組織中的非膠原性蛋白，可由成骨細胞合成，骨組織中OCN水平能夠直接反映骨形成和重建〔19〕。本研究結果說明Dex可抑制成骨細胞細胞分化，過表達LINC00189可有效促進成骨細胞分化。

PI3K/Akt信號通路是細胞內重要的信號轉導通路之一，參與調控細胞的增殖、凋亡和分化等過程〔20〕。LY294002是PI3K/Akt信號通路抑制劑，可抑制PI3K/Akt信號通路的激活。本研究結果與相關報道結果一致〔21，22〕，表明抑制PI3K/Akt信號通路可促進成骨細胞凋亡，抑制成骨細胞分化；過表達LINC00189通過激活細胞中PI3K/Akt信號通路降低Dex誘導的MC3T3-E1細胞凋亡及促進細胞分化。

綜上，Dex可誘導成骨細胞凋亡，并抑制成骨細胞分化，而過表達LINC00189可有效抑制Dex誘導的成骨細胞凋亡及促進細胞分化，其可能通過調控PI3K/Akt信號通路發揮作用，提示LINC00189有望成為治療骨質疏松的新型靶點。