基于Notch通路研究川芎嗪注射液對老年心肌梗死大鼠心肌細胞增殖、凋亡的影響

紀新博 符碧薇 顧申紅 陳菊明 麥華德 林蕓蕓 楊智

(海南醫學院 1第一附屬醫院老年醫學科，海南 ?？?570102；2基礎醫學與生命科學學院)

心肌梗死屬心血管常見危重癥之一，病情發展迅速且病死率高，心肌梗死后心肌細胞受損導致心功能不全，嚴重影響機體健康，減少心肌細胞損傷對于改善心功能具有重要意義〔1〕。川芎嗪作為中藥川芎的有效單體成分，具有改善微循環、活血化瘀等功效，對心肌梗死大鼠具有保護作用〔2〕，川芎嗪亦可抑制癌細胞增殖、促進癌細胞凋亡過程實現對疾病的保護〔3,4〕，但在心肌梗死中其是否可影響心肌梗死區細胞增殖、凋亡情況尚不清楚。因此，本研究采用左冠狀動脈前降支結扎法建立老年心肌梗死大鼠模型，探討川芎嗪注射液對老年心肌梗死大鼠心肌細胞增殖、凋亡的影響并初步探討其機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 雄性SPF級大鼠，6～10月齡，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號：SCXK(京)2018-0012。飼養條件：21～25℃，濕度40%～60%，12 h光照/12 h黑暗處理，正常飲水攝食。本實驗動物在海南醫學院第一附屬醫院暫養7 d進行實驗，本研究經海南醫學院第一附屬醫院倫理協會審核并通過。

1.2試劑與儀器 川芎嗪注射液(北京市燕京藥業有限公司，批準文號：國藥準字H20163160)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色液(北京凱瑞基生物技術有限公司，貨號：120662)；Ki67蛋白抗體(Anti-Ki67)、一抗兔抗鼠Notch、Ki67、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase-1)、三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)，二抗山羊抗兔IgG(美國Abcam公司，貨號分別為：ab197234、ab52627、ab15580、ab179515、ab181602、ab150077)；膜聯蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)細胞凋亡檢測試劑盒(碧云天生物技術有限公司，貨號：C1062S)；多普勒超聲診斷儀(濮陽市滬康醫療設備有限公司，型號：DW-C8)。

1.3研究方法

1.3.1模型建立及藥物處理 實驗前大鼠禁食過夜，26只大鼠參考文獻方法〔5〕建模，腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，固定于實驗臺上，頸正中切口，暴露出心臟后分離右頸總動脈，心導管經右側心動脈插入左心室并連接呼吸機；而后左胸第4肋間剪段肋骨，暴露出左心耳和左心室，分離做冠狀動脈前降支并結扎，檢測大鼠心電圖(ECG)，以ECG ST段明顯抬高為模型制備成功標志，共建模成功24只。模型成功后隨機分為模型組和干預組，每組12只，假手術組僅打開胸腔暴露出心臟但不結扎。

干預組每天腹腔注射120 mg/kg川芎嗪注射液〔6〕，假手術組和模型組腹腔注射等體積的生理鹽水，連續6 w。

1.3.2多普勒超聲檢測心功能指標 實驗結束后，超聲診斷儀檢測左心室收縮末期內徑(LVESD)、左心室舒張末期內徑(LVEDD)、左室射血分數(LVEF)。

1.3.3TTC染色檢測心肌梗死體積 超聲后迅速處死大鼠，其中4只摘除心臟，置于預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)中清洗，-20℃冷凍25 min，平行心室橫切成6片，0.1% TTC中37℃孵育15 min，10%甲醛中室溫固定1 h，拍照并用ImageJ軟件分析梗死百分比。正常心肌呈紅色，梗死區呈白色。

1.3.4免疫熒光檢測心肌組織中細胞增殖蛋白Ki67水平 超聲后迅速處死剩余大鼠，模型組取梗死區域組織，假手術組、干預組相同部位取心肌組織，部分置于4%多聚甲醛中制冰凍切片；部分組織置于-20℃冰箱當天待用；部分置于-80℃冰箱保存。冰凍切片置于4℃丙酮中固定10 min，通風后PBS漂洗，0.5%牛血清白蛋白(BSA)滴加切片中，室溫封閉40 min，加一抗Ki67，4℃孵育過夜；加熒光標記的二抗，核復染，共聚焦顯微鏡、Image J軟件分析增殖蛋白Ki67的免疫熒光圖像。

1.3.5流式細胞術檢測心肌組織凋亡情況 -20℃冰箱中取出心肌組織，眼科剪剪成糜狀，PBS沖洗去除血細胞，膠原酶消化15 min，吸上清繼續消化25 min，上清置于300目網篩，反復消化直至組織消化完全，取心肌細胞單細胞懸浮液100 μl(5×107個細胞)，加入5 μl Annexin-FITC和2.5 μl碘化丙啶(PI)溶液，避光孵育10 min后添加400 μl緩沖液，30 min內上機檢測并分析。

1.3.6Western印跡檢測心肌組織中Notch、Ki67、Caspase-1蛋白表達情況 從-80℃冰箱中取出心肌組織，RIPA裂解液冰上裂解心肌組織20 min，提取總蛋白，上樣20 μg行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，聚偏氟乙烯(PVDF)轉膜后封閉，一抗Notch、Ki67、Caspase-1、GAPDH，4℃孵育過夜，加入對應二抗，顯色并定量分析，蛋白相對表達水平=目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值。

1.4統計學處理 采用SPSS24.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1川芎嗪注射液對大鼠心功能影響 與假手術組相比，模型組心功能指標LVEDD、LVESD顯著升高，LVEF顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，干預組心功能指標LVEDD、LVESD顯著降低，LVEF顯著升高(P<0.05)。見表1。

2.2川芎嗪注射液對大鼠心肌梗死情況的影響 與假手術組相比，模型組心肌梗死體積顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，干預組心肌梗死體積顯著降低(P<0.05)。見表2、圖1。

2.3川芎嗪注射液對大鼠心肌細胞增殖的影響 與假手術組相比，模型組Ki67細胞數量顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，干預組Ki67細胞數量顯著升高(P<0.05)。見表2、圖2。

表1 3組心功能指標比較

表2 3組心肌梗死體積、心肌細胞凋亡、Ki67細胞數量比較

2.4川芎嗪注射液對大鼠心肌細胞凋亡的影響 與假手術組相比，模型組心肌細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，干預組心肌細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見表2、圖3。

2.5川芎嗪注射液對大鼠心肌組織中Notch、Ki67、Caspase-1蛋白的影響 與假手術組相比，模型組心肌組織中Notch、Caspase-1蛋白水平顯著升高、Ki67蛋白水平顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，干預組心肌組織中Notch、Caspase-1蛋白水平顯著降低、Ki67蛋白水平顯著升高(P<0.05)。見表3、圖4。

圖1 3組大鼠心肌梗死體積

藍色-DAPI，紅色-Ki67圖2 3組大鼠心肌細胞增殖情況(免疫熒光染色，×200)

圖3 3組大鼠心肌細胞凋亡情況

表3 3組心肌組織中Notch、Ki67、Caspase-1蛋白水平比較

圖4 3組大鼠心肌組織中Notch、Ki67、Caspase-1蛋白表達

3 討 論

人口老齡化加劇會導致心肌梗死發病率升高，嚴重影響患者生存質量和存活壽命〔7〕?；颊咴谘鲃恿W、神經體液等作用下易發生心肌重構，表現為左心室形狀及結構改變，伴有心肌細胞肥大、代償性肥厚等出現，最終發生心力衰竭〔8〕。川芎在臨床上具有活血化瘀功效，川芎嗪作為川芎主要有效成分之一，可改善血流動力學、神經功能指標，從而治療血管類疾病〔9〕。本研究結果提示左冠狀動脈前降支結扎建立老年心肌梗死大鼠模型后，心肌組織出現大面積梗死，且心功能發生變化，若持續梗死則可能造成心肌缺血導致心肌細胞壞死和凋亡、抑制細胞增殖等現象；川芎嗪干預心肌梗死模型大鼠后，心肌梗死現象得到緩解，心肌狀況、心功能有所改善。

細胞增殖可以誘導內皮細胞增生，形成心血管，從而影響疾病進程〔10〕。誘導胚胎干細胞衍生的心肌細胞核內皮細胞增殖，可促進血管生成，從而改善心功能、增加毛細血管密度，進而緩解受損心肌情況，緩解心肌梗死情況〔11〕。增殖蛋白Ki67作為標志性增殖蛋白，反映心肌細胞再生情況〔12，13〕；在急性心肌梗死中其水平下降，與血流動力學和心肌氧化應激損傷關系密切〔14〕。本研究結果提示可能心肌梗死情況下心肌細胞增殖降低，不能形成新的血管，使心肌組織不能發揮正常作用。川芎嗪干預心肌梗死模型大鼠后，心肌細胞增殖情況得到緩解。

正常情況下細胞凋亡可促進細胞新陳代謝，是清除衰老細胞的重要機制，也是機體免疫系統清除異常細胞的主要途徑，使機體行使正常功能；其異常新陳代謝加重疾病進程〔15〕。心肌梗死患者發生心肌缺血性缺氧、缺血性壞死，易導致內質網折疊，而內質網折疊錯誤導致蛋白的積累及鈣離子失衡，誘導細胞凋亡途徑產生〔16〕。凋亡蛋白數量較多，其中Caspase家族是目前發現與凋亡家住關系最為緊密的家族，調控細胞凋亡情況〔17〕。其中Caspase-1作為Caspase家族一員，當細胞受到刺激時可促進細胞膜形成親水通道，導致細胞膨脹裂解，是多種疾病發病的中心環節〔18〕。本研究結果提示心肌組織中內質網等細胞器發生變化，從而誘導凋亡蛋白加劇，促使凋亡途徑加劇，加重疾病進程；川芎嗪干預心肌梗死模型大鼠后，心肌凋亡途徑受抑制，從而緩解疾病進程。

Notch信號通路在心血管疾病中發揮重要作用，與心肌重構關系密切〔19〕。Notch受體和配體在心肌細胞中均表達，在衰竭和未衰竭心肌細胞中表達存在差異，在心肌損傷中被激活，并影響細胞增殖、分化、凋亡等情況〔20〕。本研究結果提示Notch通路在心肌梗死大鼠中被激活發揮功能；川芎嗪干預心肌梗死模型大鼠后，可能通過抑制Notch信號通路實現對心肌細胞增殖、凋亡情況的緩解，從而實現對心肌梗死的保護。

綜上所述，川芎嗪注射液可保護老年心肌梗死，可能是通過抑制Notch信號通路實現對心肌細胞增殖的促進、凋亡的抑制。但Notch下游影響因子眾多，對增殖、凋亡的直接作用情況尚需進一步研究。