特異性抗體IMab-1在人腦膠質(zhì)瘤IDH1基因突變檢測中的臨床價值

李航 于佳龍 羅勇 蔣其俊 楊開華

(遵義市第一人民醫(yī)院(遵義醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院)神經(jīng)外科，貴州 遵義 563000)

腦膠質(zhì)瘤是常見的顱內(nèi)惡性腫瘤之一，占原發(fā)性腦部腫瘤的60%以上〔1〕。腦膠質(zhì)瘤患者的病死率和殘疾率極高。根據(jù)惡性程度，世界衛(wèi)生組織(WHO)通常將膠質(zhì)瘤分為Ⅰ～Ⅳ 4個級別。Ⅰ和Ⅱ型通常被劃分為低級別膠質(zhì)瘤，Ⅲ和Ⅳ型則被劃分為高級別膠質(zhì)瘤〔2〕。長期以來，針對腦膠質(zhì)瘤發(fā)病機制的研究有限，相應的治療手段有限，療效有限，如臨床常用替莫唑胺等藥物治療等，因此，尋找新臨床診療措施的意義重大。近年來，隨基礎醫(yī)學研究的迅速發(fā)展，科學家們發(fā)現(xiàn)了許多膠質(zhì)瘤的分子標記，特別是異檸檬酸脫氫酶同工酶(IDH)突變與原發(fā)性膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關〔3，4〕。

有報道在2008年指出，在膠質(zhì)母細胞瘤外顯子序列中發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤與IDH1突變有關，并且IDH1基因132位的精氨酸(R)被發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化為組氨酸(H)〔5〕。后續(xù)研究表明，IDH1 R132H突變是膠質(zhì)瘤中最常見的突變〔6〕，且80%～90%的Ⅰ和Ⅱ型膠質(zhì)瘤存在IDH突變〔7〕。多項研究表明，繼發(fā)性膠質(zhì)母細胞瘤中多見IDH1 突變，且其陽性率出現(xiàn)發(fā)病年齡降低的趨勢，同時，IDH1 突變在彌漫性星形細胞瘤與少枝膠質(zhì)細胞瘤也被發(fā)現(xiàn)，且專屬性較強〔8～10〕。本研究采用IMab-1作為IDH1 R132H 的特異性抗體，聯(lián)合免疫組化及Western印跡檢測方法，測定人腦膠質(zhì)瘤中IDH1 基因突變發(fā)生情況，探討檢測方法的可靠性及在腦膠質(zhì)瘤檢測中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1一般資料 選取2012年1月至2019年1月遵義市第一人民醫(yī)院、遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院及貴州航天醫(yī)院的腦膠質(zhì)瘤標本107例。其中，男60例，女47例，年齡37～85歲，平均(60.5±4.2)歲。病理分型依據(jù)2007年WHO神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤新分類標準，包括Ⅰ級8例、Ⅱ級48例、Ⅲ級28例、Ⅳ級23例。另取其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)腫瘤標本18例，包括腦膜瘤8例，垂體瘤6例，中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤4例。取腦外科手術治療的內(nèi)減壓正常腦組織20例為對照。

1.2試劑與儀器 鼠抗人IDH1抗體購自德國Dianova公司；羊抗鼠二抗購自美國Abcam公司；蛋白提取試劑盒購自美國Invent Biotechnologies公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜、電化學發(fā)光(ECL)液、放射免疫沉淀法(RIPA)蛋白裂解液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒由上海碧云天生物技術有限公司提供；人IDH 基因組序列來自GenBank，引物由上海美吉生物技術有限公司提供；RNA提取試劑盒、聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒由美國ABI公司提供；PCR儀由美國Bio-Rad公司生產(chǎn)；Triolz和熒光定量檢測試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；美國ABI3730測序儀進行基因片段測序；96孔純化板購自美國Millipore公司。

1.3免疫組化 SP法進行免疫組化：切片常規(guī)脫蠟，3%過氧化氫(80%甲醇)阻斷過氧化物酶，正常山羊血清封閉，行微波爐抗原修復后，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2～3次，甩去多余液體；滴加Ⅰ抗(鼠抗人IDH1抗體，DIANOVA，Clone H09)，4℃過夜，37℃復溫45 min。PBS洗3次各5 min；滴加Ⅱ抗(辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗)，37℃，1 h，鏈酶親和素-過氧化物酶溶液10 min，PBS或自來水沖洗10 min；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色2 min，中性樹膠封片，晾干，顯微鏡下觀察。

1.4Western印跡 將適量的膠質(zhì)瘤(約400 mg)置于-80℃冰箱中保存，放入標記管中，用4℃PBS洗滌5 min(4次)。清洗后，用剪刀剪開肺組織，加入裂解液，再加入苯甲基磺酰氟(PMSF)到裂解液中。裂解液與PMSF的比例為100∶1，用攪拌棒充分研磨10 min，將裂解后的樣品置于高速冷凍臺式離心機中，以13 000 r/min離心5 min，除去上清液，丟棄剩余顆粒，樣品保存在-80℃冰箱中進行蛋白質(zhì)含量測定。冰上勻漿，使用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取組織總蛋白，使用細胞質(zhì)和核提取試劑盒(USA)提取細胞核和細胞質(zhì)蛋白質(zhì)，Bradford 法測定蛋白濃度。每孔加入50 μg蛋白，10%～12% SDS-PAGE分離，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，孵育一抗鼠抗人IDH1抗體，4℃過夜，次日室溫孵育辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗2 h。電化學發(fā)光法檢測，曝光、顯影，采用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照，Image J軟件對相應條帶進行灰度分析。

1.5結(jié)果判斷 (1)免疫組化染色陽性判定標準：細胞胞質(zhì)中有棕黃色或棕色顆粒；閱讀過程由2位經(jīng)驗豐富的病理學家同時進行盲法評估，以雙半定量法進行評分。操作詳細步驟：顯微鏡下隨機定位高倍視野觀察點8個，同時手工記錄鏡下的高倍視野中顯示4個陽性染色結(jié)果的百分率。突變陽性率10%以上的IDH1突變?yōu)殛栃耘袛鄻藴省?2) Western印跡陽性檢測：經(jīng)PVDF膜顯示結(jié)果，若52 kD附近顯示陽性條帶，則可將結(jié)果判斷為IDH1突變陽性。

1.6基因片段測序 基因組經(jīng)提取DNA后，進行PCR擴增與純化：引物設計軟件Primer5.0設計目標引物。參考模板為人IDH基因組序列(GenBank登錄號：NM 005896)，引物由上海美吉生物技術有限公司合成。引物序列：IDH正義鏈：5′-CAAGCCGAGAATGCTGAGTTCAT-G-3′，反義鏈：5′-GCAA-GGGATGATTTCCTGCCAG-3′。PCR擴增反應體系包括10×ExTaq緩沖液(3 μl)，IDH-正義鏈(3 mmol/L)溶液(2.5 μl)，IDH-反義鏈(3 mmol/L)溶液(2.5 μl)，純凈水(18.8 μl)，DNA(1 μl)，脫氧核糖核苷酸(dNTP)溶液(2.5 mmol/L,0.5 μl)，Ex Taq溶液(0.2 μl)，混合齊全后，進行PCR擴增反應，反應完成后，按照Millipore 公司96純化板操作流程操作，經(jīng)轉(zhuǎn)板操作后，使用ABI3730型測序分析儀進行測序。

1.7統(tǒng)計學方法 采用Graphpad Prism6軟件進行χ2或Fisher精確概率檢驗。

2 結(jié) 果

2.1不同病理類型腫瘤染色 不同病理類型腫瘤(IDH1基因突變)的胞質(zhì)呈棕褐色或棕黃色，強度不同。見圖1。

A.IDH1 突變陰性彌漫性星形細胞瘤;B.IDH1突變陽性繼發(fā)性膠質(zhì)母細胞瘤;C.IDH1突變陽性原發(fā)性膠質(zhì)母細胞瘤;D.IDH1突變陽性彌漫性星形細胞瘤圖1 不同病理類型腫瘤(免疫組化染色，×400)

2.2Western印跡 IDH1 R132H突變陽性蛋白在52 kD附近顯示明顯的電泳條帶，而野生型(WT)IDH1 R132H蛋白未見陽性條帶，見圖2。

1～4：彌漫性星形細胞瘤,間變性星形細胞瘤,少枝膠質(zhì)細胞瘤，間變性少枝膠質(zhì)瘤；132H：IDH1 R132H 突變型圖2 Western印跡檢測結(jié)果

2.3基因測序結(jié)果 WT IDH1 基因在R132 位點顯示CGT正常單峰形態(tài)；IDH1 R132H基因突變主要為雜合性點突變，該基因132 位點因為核苷酸突變(CGT→CAT)，蛋白表達由組氨酸取代原編排的精氨酸位點，而CAT 序列中的A 位置顯示典型的雙峰形態(tài)。

2.4IDH1突變3種檢測方法比較 IDH1 基因陽性檢測結(jié)果：基因片段測序方法(A組)為54例，免疫組化法(B組)為45例，Western印跡(C組)為49 例，3組結(jié)果無顯著差異(P>0.05)，見表1。

表1 3種檢測方法IDH1突變比較(n)

3 討 論

IDH催化異檸檬酸產(chǎn)生α-酮戊二酸(KG)。當IDH1基因突變時，其相應的功能和產(chǎn)物會發(fā)生變化。它通過產(chǎn)生高水平的2-羥基戊二酸(Hg)，使機體的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)水平上調(diào)，加速形成腫瘤微環(huán)境，另外，體內(nèi)的低氧誘導因子(HIF)-1α水平也因此增長迅速，加速膠質(zhì)瘤對正常組織的侵襲，從而抑制膠質(zhì)瘤干細胞的分化。導致膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展〔11～13〕。研究表明，星形細胞瘤或膠質(zhì)母細胞瘤中的IDH1基因突變較為頻繁，室管膜瘤、髓母細胞瘤等其他膠質(zhì)瘤中IDH1基因突變較為少見〔14〕。本文選取的不同病理類型的腦膠質(zhì)瘤中，毛細胞星形細胞瘤室管膜瘤、間變室管膜瘤、髓母細胞瘤均未檢出IDH1基因突變。其中，IDH1基因突變位點基本位于異檸檬酸鹽的結(jié)合部位的進化保守區(qū)域132 位點，突變類型大多部分為雜合型〔15〕。

基因突變的檢測方法較多，包括基因測序、免疫組織化學及Western印跡等。基因測序在現(xiàn)階段的應用較廣，該檢測方法也是 IDH1 基因突變的最常用手段〔16〕。特別是臨床診療方面，由于精準醫(yī)學概念的提出，個體化治療顯得尤為重要。基因測序作為臨檢常用手段，伴隨腫瘤治療的全生命周期。臨床對腫瘤的檢測結(jié)果的可信度基本來源于對腫瘤DNA的序列分析。近年來，隨人工智能及生物醫(yī)學的快速發(fā)展，臨床快速測序技術已經(jīng)達到一個新的高度，患者接受該技術檢測的費用及時間均顯著減少〔17〕。唯一的不足為該技術檢測的準確性基于樣本的高度純凈性，若腫瘤周圍正常腦組織的DNA 受到污染或淋巴細胞浸潤較多，其中的小神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤和內(nèi)皮細胞即可稀釋IDH1基因突變相關DNA信息，造成DNA信號低于檢測限，產(chǎn)生假陰性結(jié)果，相反，目標信號的降低，相對抬高了背景信號的水平，也可能使原本陰性的結(jié)果轉(zhuǎn)變?yōu)榧訇栃浴Ｑ芯勘砻鳎瑴蚀_可信的測序檢測結(jié)果主要基于至少需要20%以上突變的等位基因〔18〕。隨分子生物學的快速發(fā)展，測序所需的特異性抗體也日新月異，穩(wěn)定性IDH1 R132H 特異性抗體IMab-1的出現(xiàn)使IDH1基因突變的檢測在常規(guī)病理實驗室也能實現(xiàn)〔19〕。

另外，作為特異性的IDH1 R132H 抗體，IMab-1不與WT IDH1 基因及其他類型基因反應。經(jīng)ELISA后，如果細胞胞質(zhì)被染色呈棕褐色或棕黃色則表明IMab-1 染色陽性。常規(guī)情況下，IDH1 基因突變特異性表達于腫瘤細胞，因此其他體細胞經(jīng)ELISA后不會被染色。

有報道顯示，IDH1基因突變表達在毛細胞星形細胞瘤中未見，而在彌漫性星形細胞瘤中的表達明顯增強，兩者的組織病理診斷較為混淆，利用IMab-1可有效鑒別兩者病理類型〔13〕；同時，臨床發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤患者若見IDH1突變陽性，則其預后優(yōu)于IDH1突變陰性患者，因此，如果早期選擇了特異性抗體IMab-1進行IDH1基因突變檢測，可有效評估相關疾病的預后〔20〕。另外，本研究發(fā)現(xiàn)IMab-1染色強度與腫瘤病理分級無關，其原因可能為IDH1基因突變主要見于腫瘤發(fā)生的早期階段，且不會隨腫瘤的進展而出現(xiàn)明顯增強現(xiàn)象；其次可能由于樣本的不純凈性，本研究選取的膠質(zhì)瘤樣本中夾雜其他細胞，包括壞死組織、血液細胞、血管內(nèi)皮細胞等，IDH1基因突變在這些組織中的表達均為陰性，最后可能與本研究的檢測手段相關，試驗中常用的檢測手段的檢測結(jié)果均存在假陰性率可能性，其差異性來源主要包括樣品前處理過程與基因測序無法做到完全一致所致〔21〕。因此，采用多種方法檢測，可有效降低檢測的假陽性率及假陰性率。另外，本研究提示，只要樣本采集及制作過程有效避免相關因素干擾，3種檢測均可達到較為理想的檢測結(jié)果。

綜上，基于免疫組化及Western印跡技術，選用IDH1 R132H基因突變的特異性抗體IMab-1，可有效檢出早期腦膠質(zhì)瘤的進展狀況，可為膠質(zhì)瘤IDH1基因突變的篩選及相關疾病的預后評估提供理論依據(jù)。