cSN50.1對糖尿病大鼠腎損傷的影響

欒海艷 周建基 張寶媛 劉明遠 劉杰 李楠

(佳木斯大學(xué) 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2微生態(tài)-免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)與相關(guān)疾病重點實驗室)

中國是患有糖尿病人數(shù)最多的國家之一，占全球24%，2017年糖尿病的發(fā)生率已達到11.2%，并呈現(xiàn)逐年上升趨勢〔1〕。糖尿病也是目前已知并發(fā)癥種類最多的一種疾病，其中最常發(fā)生的慢性并發(fā)癥是糖尿病腎病(DN)，據(jù)統(tǒng)計糖尿病患者中20%～40%會并發(fā)DN，且往往會發(fā)展成為終末期腎病(ESRD)，患者5年生存率<20%。到2030年，DN將成為世界第七大致死疾病。患者不僅需要腎臟替代治療，還需治療比其他尿毒癥患者更多更嚴(yán)重的合并疾病，不但耗費了大量衛(wèi)生醫(yī)療資源，也給患者本人及其家屬造成了沉重的心理壓力和經(jīng)濟負擔(dān)。本文旨在探討人工合成的多肽cSN50.1對糖尿病大鼠腎損傷的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗對象及分組 清潔級雄性純系SD大鼠，體重180～220 g，購于黑龍江省佳木斯大學(xué)實驗動物中心，所有實驗大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后分為兩組：正常對照組給予常規(guī)基礎(chǔ)飼料飲食，模型建造組給予含高脂高糖的特殊飼料飲食；喂養(yǎng)4 w后，模型建造組一次性腹腔注射2%鏈脲佐菌素(STZ，35 mg/kg，用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制)，正常對照組同時注射與模型建造組等體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液；并在72 h后測定兩組空腹血糖(FBG)水平；將符合血糖標(biāo)準(zhǔn)的大鼠(≥16.7 mmol/L)再分為模型對照組、cSN50.1低劑量組和cSN50.1高劑量組，均繼續(xù)給予含高脂高糖的特殊飼料喂養(yǎng)直至整個實驗完成。而正常對照組仍繼續(xù)給予常規(guī)的基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)。

1.2給藥方案 從第9周起cSN50.1低劑量組、cSN50.1高劑量組分別給予15、30 mg/kg cSN50.1腹腔注射，2次/d；同時正常對照組和模型對照組注射等體積的生理鹽水，藥物干預(yù)持續(xù)4 w后進行指標(biāo)檢測。

1.3留取標(biāo)本及檢測指標(biāo) 實驗完成后，計量各組24 h尿液，并采用全自動生化儀檢測尿蛋白(UPr)和尿肌酐(UCr)等腎功能生化指標(biāo)，并計算UPr與UCr的比值。乙醚麻醉后，各組大鼠內(nèi)眥靜脈取血，采用全自動生化儀檢測尿素氮(BUN)和FBG；大鼠處死后，稱量各組大鼠腎濕重和體重，計算腎指數(shù)(腎濕重/體重)；再分別取出兩腎，左腎于-80℃冰箱保存，采用RT-PCR技術(shù)檢測腎組織中纖維連接蛋白(FN)、Ⅰ 型膠原蛋白(Collagen Ⅰ)、Collagen Ⅳ和內(nèi)參照β-actin的基因表達情況，各目的基因表達的相對含量采用目的基因與β-actin灰度值的比值表示，右腎用甲醛溶液浸泡固定后，石蠟包埋切片，采用蘇木素-伊紅(HE)染色技術(shù)檢測腎組織病理變化情況。

1.4試劑 多肽cSN50.1的合成由吉爾生化(上海)有限公司完成；STZ購于Sigma公司；FBG、BUN、UPr、UCr測試試劑盒購于南京建成生物工程研究所；FN、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅳ和β-actin引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計兼合成。引物序列：FN正義：5′-CCCATCGACCAGTGCCAAGATTC-3′，反義：5′-TTCCTTCCAGCGACCCGTAGAG-3′；Collagen Ⅰ正義：5′-TTCT CCTGGCAAAGATGGACTCAAC-3′，反義：5′-GGGCTGCGGATGTTCTCAATCT-G-3′；Collagen Ⅳ正義：5′-ACTTCGCCTCCAGGAA CGACTAC-3′，反義：5′-GGGCACTTCTAAACT-CTTCCAGACAG-3′；β-actin正義：5′-TGTCACCAACTGGGACGATA-3′，反義：5′-GGGGTGTTGAAGGTCTCA AA-3′。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組FBG水平和腎功能指標(biāo)比較 與正常對照組相比，模型對照組FBG、BUN、UPr、UCr及UPr/UCr顯著升高(P<0.01)；cSN50.1低劑量組、cSN50.1高劑量組較模型對照組均顯著降低(P<0.01，P<0.05)；與正常對照組相比，cSN50.1低劑量組各指標(biāo)水平仍有顯著差異(P<0.01)，cSN50.1高劑量組FBG、BUN、UPr和UCr有顯著差異(P<0.01，P<0.05)，但UPr/UCr無明顯差異(P>0.05)，見表1。

表1 各組FBG和腎功能水平比較

2.2各組腎指數(shù)比較 與正常對照組腎指數(shù)〔(5.45±0.47)×10-3〕相比，模型對照組〔(11.29±0.92)×10-3〕顯著升高(P<0.01)；cSN50.1低劑量組〔(9.47±1.66)×10-3〕較模型對照組明顯下降(P<0.05)，cSN50.1高劑量組〔(7.39±0.62)×10-3〕顯著下降(P<0.01)，但與正常對照組相比，cSN50.1低劑量組和高劑量組未恢復(fù)到正常水平，仍有顯著差異(均P<0.01)。

2.3各組腎組織病理變化情況 HE染色結(jié)果顯示，正常對照組大鼠腎組織形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)清晰；而模型對照組腎組織中腎小球體積有所增大，局部腎小管出現(xiàn)腫脹壞死，并伴有空泡樣變性現(xiàn)象，系膜基質(zhì)也出現(xiàn)增多現(xiàn)象，此外還有炎性浸潤等病理損傷；與模型對照組比較，cSN50.1低劑量組和cSN50.1高劑量組大鼠腎組織病理損傷減輕，見圖1。

圖1 各組腎組織病理變化情況(HE染色，200 μm)

2.4各組腎組織中FN、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅳ基因表達比較 與正常對照組相比，模型對照組腎組織FN、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅳ mRNA表達均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；cSN50.1低劑量組和cSN50.1高劑量組較模型對照組均顯著降低(P<0.01)，但與正常對照組相比，仍未恢復(fù)到正常水平，有明顯差異(P<0.01，P<0.05)，見表2，圖2。

表2 各組FN、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅳ mRNA表達

1～4：正常對照組、模型對照組、cSN50.1低劑量組、cSN50.1高劑量組圖2 各組FN、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅳ mRNA表達

3 討 論

DN是一種發(fā)病機制紛繁復(fù)雜的慢性疾病，目前公認(rèn)與之發(fā)病相關(guān)的因素主要包括：基因遺傳、糖脂代謝紊亂、血流動力學(xué)異常、氧化應(yīng)激刺激、炎癥反應(yīng)等〔2〕。其中，炎癥在DN中的作用已越來越得到大家關(guān)注，幾乎參與了DN發(fā)生發(fā)展的全過程〔3～5〕，因此，DN也可以被認(rèn)為是一種由糖脂代謝紊亂引發(fā)的炎癥性疾病〔6〕。研究發(fā)現(xiàn)，高血糖、高脂血癥和高胰島素血癥等代謝性因素均可通過多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活糖尿病患者腎組織內(nèi)的固有細胞(如血管內(nèi)皮細胞、足細胞、系膜細胞和腎小管上皮細胞)，引起這些細胞中的趨化因子、黏附因子、細胞因子等的表達增高，從而募集其他炎癥細胞(如巨噬細胞和淋巴細胞等)，而這些被募集到的炎性細胞又能釋放出更多的炎癥細胞因子去刺激腎小管上皮細胞，使腎小管上皮細胞繼續(xù)釋放出更多的炎癥介質(zhì)、趨化因子及細胞因子，形成惡性循環(huán)，使炎癥反應(yīng)進一步加劇，出現(xiàn)UPr，甚至使腎組織出現(xiàn)病理性改變，腎小球基膜增厚、硬化，腎小管間質(zhì)纖維化，最終逐漸進展成終末期腎臟病〔7～9〕。

cSN50.1是一種人工合成的多肽，已被證實在由多病因引起的炎癥性疾病中具有較好的作用。研究發(fā)現(xiàn)，cSN50.1可以通過與核轉(zhuǎn)運蛋白(importin)α和importin β結(jié)合，競爭性抑制應(yīng)激反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子(SRTFs)的入核轉(zhuǎn)運，減少敗血癥小鼠血液、脾和肺的細菌負荷，降低血漿中促炎細胞因子和趨化因子的表達，將cSN50.1與抗生素相結(jié)合還能明顯延長小鼠的平均生存時間〔10〕。此外，cSN50.1還可以通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子的入核轉(zhuǎn)運，減輕低密度脂蛋白(LDL)受體缺乏小鼠的代謝炎癥，調(diào)控其膽固醇、三酰甘油和脂肪酸的合成，局部糾正脂質(zhì)代謝紊亂、高血糖癥、高膽固醇血癥、高脂血癥、脂肪沉滯性動脈硬化癥和脂肪肝〔11〕。本研究結(jié)果提示腹腔注射cSN50.1能夠明顯降低2型糖尿病模型大鼠FBG、BUN、UPr、UCr及UPr/UCr水平，改善其血糖和腎功能異常情況；且cSN50.1還能使模型大鼠的腎指數(shù)下降，改善其腎臟肥大的情況；此外，cSN50.1還可以減輕模型大鼠腎組織的腎小球體積增大，系膜基質(zhì)增多，腎小管腫脹壞死，炎性浸潤等病理損傷情況。

DN腎組織損傷的主要病理特征是腎小球基底膜增厚、細胞外基質(zhì)形成增多、細胞的足突消失，最終導(dǎo)致腎小球濾過率(GFR)降低，UPr增加，腎小球和腎小管發(fā)生間質(zhì)纖維化〔12,13〕，而腎間質(zhì)纖維化也是其他慢性腎臟疾病發(fā)展至終末期腎病的共同路徑〔14,15〕。研究發(fā)現(xiàn)，形成腎間質(zhì)纖維化的重要因素是細胞外基質(zhì)的合成降解失衡，腎小球和腎間質(zhì)內(nèi)大量積聚并沉積的細胞外基質(zhì)可引起腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生〔16,17〕。FN、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅳ是細胞外基質(zhì)的主要成分〔18,19〕，隨著間質(zhì)中細胞外基質(zhì)的積累和小管基底膜破壞，F(xiàn)N、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅳ均出現(xiàn)過度表達現(xiàn)象，因此是評判腎纖維化程度的重要指標(biāo)〔20〕。本研究結(jié)果表明cSN50.1能夠降低糖尿病模型大鼠腎組織中致纖維化因子的表達水平，從而減輕大鼠腎組織的病理損傷程度。

綜上，cSN50.1對糖尿病大鼠的腎損傷具有一定保護作用，這可能與cSN50.1可降低大鼠腎組織中纖維化因子FN、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅳ mRNA的表達有關(guān)。