黃芪及其發酵物對碘缺乏大鼠抗氧化系統的保護

李超 楊偉偉 王梅 王雪 劉翠翠 陳俊榮

(1滄州醫學高等專科學校藥理教研室，河北 滄州 061001；2滄州市中心醫院婦二科)

在人體的生長發育過程中，碘是不可或缺的，有研究表明，體內碘缺乏會導致多種疾病，并引起能量代謝功能障礙及其氧化系統損傷等〔1〕。黃芪是常見的補氣中草藥，有抗氧化、調節免疫功能、促進機體代謝和延緩衰老等作用〔2〕，通過對中藥黃芪進行發酵制備可使其有效利用〔3〕。本實驗探討黃芪及其發酵物對碘缺乏誘導的大鼠抗氧化系統損傷的保護作用和相關機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 80只SPF級Wistar大鼠，4周齡，雌雄各半，體重100～120 g，由斯貝福(北京)生物技術有限公司提供，大鼠許可證號：SCXK(京)2016-0002，使用許可證號：SYXK(冀)2019-006。12 h晝夜循環，飼養溫度(22±2)℃，濕度(60±5)%。動物的使用及操作按照滄州醫學高等專科學校實驗動物管理委員會(IACUC2019046)的規定執行。動物實驗過程中遵守3R原則。

1.2儀器和試藥 超速冷凍離心機(Sigma 3K15)購自德國Sigma公司；酶標儀(Spectra MaxM4)購自美國分子公司；微型混勻器(H-1)購自上海康和光電儀器有限公司；水浴恒溫振蕩器(SHA-B)購自常州國華電器有限公司；Morris水迷宮購自上海欣軟信息科技有限公司。血清皮質醇(CoRT)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒購自上海雅吉生物科技有限公司(貨號：YS03606B)；總抗氧化能力(T-AOC，貨號：A015-2-1)、單胺氧化酶(MAO，貨號：A034-1-1)、乳酸(LD，貨號：A019-2-1)、乳酸脫氫酶(LDH，貨號：A020-2-2)、ATP酶(ATPase)檢測試劑盒(貨號：A070-2-2、A070-5-1、A070-4-2)均購自南京建成生物工程研究所。碘缺乏飼料(碘含量20 μg/kg)由北京小黍有泰生物科技有限公司提供，許可證號SCXK(京)2016-0007。

1.3實驗藥品的制備 黃芪提取液〔4〕和黃芪發酵提取液〔5〕(滄州醫學高等專科學校實驗室自制)分別將生藥稀釋成4、2、1 g/kg備用。

1.4方法

1.4.1實驗分組 取SPF級Wistar大鼠4周齡80只，體重100～120 g，按體重分為8組：正常組，模型組，高、中、低劑量黃芪組(4、2、1 g/kg)及高、中、低劑量發酵物組(4、2、1 g/kg)，每組雌雄各半分籠飼養。正常組全程飼以普通飼料，每日等體積雙蒸水。其余組大鼠飼以低碘飼料，每日等體積雙蒸水。3個月后復制出碘缺乏致甲狀腺腫模型〔6〕。造模后，除正常組和模型組外各組大鼠均按10 ml/kg予以相應藥物，每日1次，連續給藥4 w，正常組、模型組給予等體積雙蒸水。實驗期間繼續給藥。

1.4.2Morris水迷宮實驗 造模后31 d進行Morris水迷宮實驗。水池直徑為160 cm，池壁分為NW、SW、SE、EN 4個象限，水溫控制在(22±1)℃，在SW象限中心的水面下2 cm處放置1個透明平臺。①適應階段：在正式實驗前1 d將大鼠放置水池中任意游60 s，讓其自由適應環境；②定位航行實驗：該階段共進行4 d，每天4次，每次將大鼠從不同象限的中點位置面朝池壁放入水中，記錄每次從入水點到找到水下平臺的時間(即逃避潛伏期)〔7〕。實驗記錄總時長為90 s，若大鼠在90 s內未能找到平臺，則手動引導其到達平臺30 s，此次的逃避潛伏期計為90 s。

1.4.3樣本采集及其臟器系數的測定 Morris水迷宮實驗結束后禁食24 h，股靜脈取血分離血清，同時迅速取出腦組織，冰盒上快速小心剝離出大鼠的腦組織，去除表面結締組織，濾紙擦干，分別稱重并計算腦系數(腦系數=腦重量/體重×100%)。血清及腦組織置于-80℃冰箱保存待測。

1.4.4大鼠血清T-AOC活力和MAO、CoRT含量測定 取適量血清依據試劑盒說明分別測定大鼠血清中T-AOC活力和MAO的含量，ELISA檢測CoRT含量。

1.4.5大鼠腦組織LD含量及LDH、ATP酶活力測定 取適量腦組織，分別以1∶9(M∶V)加入4℃生理鹽水進行組織勻漿，采用相關試劑盒測定總蛋白、LD含量及LDH、ATP酶活力。

1.5統計學方法 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1各組Morris水迷宮實驗逃避潛伏期比較 與正常組比較，實驗第2天開始模型組逃避潛伏期均顯著延長(均P<0.05)；與模型組比較，實驗第2天開始高劑量黃芪組及高劑量發酵物組逃避潛伏期均顯著縮短(均P<0.05)。見表1。

表1 各組Morris水迷宮實驗逃避潛伏期比較

2.2各組體重、腦系數比較 與正常組比較，模型組體重及腦系數均顯著降低(均P<0.05)；與模型組比較，高、中劑量黃芪組及高、中劑量發酵物組體重均顯著增加，高劑量黃芪組及高劑量發酵物組腦系數均顯著升高(均P<0.05)。見表2。

表2 各組體重及腦系數比較

2.3各組血清T-AOC活力及MAO、CoRT含量比較 與正常組比較，模型組T-AOC活力顯著降低，MAO、CoRT水平均顯著升高(均P<0.05)；與模型組比較，高劑量黃芪組及高劑量發酵物組T-AOC活力顯著升高，高、中劑量黃芪組及高、中劑量發酵物組MAO、CoRT水平均顯著降低(均P<0.05)。見表3。

2.4各組腦組織中LD、LDH及ATP酶水平比較 與正常組比較，模型組LD水平顯著升高，LDH、鈉鉀ATP酶、鈣鎂ATP酶、鈣ATP酶水平均顯著降低(均P<0.05)；與模型組比較，高劑量黃芪組及高劑量發酵物組LD水平顯著降低，LDH、鈉鉀ATP酶、鈣鎂ATP酶、鈣ATP酶水平均顯著升高(均P<0.05)。見表3。

表3 各組血清T-AOC活力、MAO、CoRT含量、腦組織LD、LDH及ATP酶水平比較

3 討 論

學習記憶障礙是碘缺乏所致甲狀腺功能減退癥患者普遍的臨床表現〔8〕。學習記憶功能還與中樞神經遞質代謝密切相關〔9〕，其中單胺類神經遞質在學習記憶過程中不可忽視。有研究表明單胺類神經遞質可參與神經內分泌或內分泌免疫網的調節，從而影響機體的精神行為、學習、記憶等功能〔10，11〕。MAO廣泛存在于不同器官、組織中，它是分解體內單胺類物質的重要酶系〔12〕。

正常條件下，甲狀腺激素的合成與代謝都伴隨自由基產生，而甲狀腺對氧化應激引起的損傷有完善的保護系統，維持機體正常的氧化平衡〔13〕。碘與甲狀腺氧化損傷密切相關〔14〕。缺碘可引起甲狀腺氧化損傷，導致下丘腦-垂體-腎上腺軸發生功能變化，引起垂體、腎上腺皮質功能亢進，分泌大量CoRT，導致并發癥，這可能是碘缺乏導致甲狀腺疾病的機制之一〔15〕。在氧化應激等條件刺激下，神經系統發生退行性變，當機體處于亞健康或疾病狀態時，血清T-AOC可作為疾病的診斷和預測指標〔16，17〕。碘缺乏可造成血清T-AOC活力顯著降低和應激代謝產物CoRT含量顯著增加。

碘對促進人體生長發育與維持能量代謝有非常重要的作用，碘缺乏影響大鼠的攝食、飲水、排泄等生理活動，引起能量利用障礙〔18，19〕。乳酸是糖酵解終產物，LD增加，LDH活力降低，引起腦膠質細胞損害，出現功能障礙〔20〕；鈉鉀ATP酶、鈣鎂ATP酶和微量鈣ATP酶是鈣離子分布的基礎，當這些ATP酶活性降低時，導致神經細胞內Ca2+濃度急劇增高，引起細胞膜結構及其骨架不穩定，使通透性增加，造成ATP大量耗竭，腦細胞能量代謝嚴重受損〔21，22〕。

綜上，黃芪發酵物能改善碘缺乏誘導的氧化應激系統損傷，其保護機制主要是通過抑制單胺類神經遞質，改善能量代謝障礙，提高抗氧化系統的防御能力而發揮其治療作用來實現。