宮頸癌大鼠模型血清miR-143表達及其對腫瘤生長的影響機制

程細云 申昌梅 余瑛

(贛州市腫瘤醫院，江西 贛州 341000)

患者在宮頸癌早期可能不會出現明顯癥狀，隨著疾病的逐漸發展，患者會伴隨經期延長、經量增多及陰道異常排液，宮頸癌晚期時腫瘤會壓迫直腸及盆腔神經，導致患者排便異常及極度消瘦和困乏〔1～3〕。由于大部分早期宮頸癌患者表現出極強的隱匿性，若不能盡早篩查與確診會延誤最佳治療時機，壓迫和侵犯鄰近器官會使宮頸癌的臨床治療更加復雜，對患者的預后產生嚴重影響〔4〕。因此，研究宮頸癌的針對性治療指標成為目前宮頸癌的研究重點，其對疾病篩查及靶向治療都有非常重要的臨床意義。miRNA是一類非編碼內源性的單鏈核苷酸，不同種類的miRNA被發現其在腫瘤疾病的發展中起到促進或是抑制的調控作用〔5～7〕。有學者指出，人乳頭瘤病毒(HPV)感染機體過程會表達特殊miRNA，其異常表達或許能調控宮頸癌的進展〔8～10〕。miR-143被發現與多類癌癥疾病存在關系，并且是患者的一系列臨床特征的有關影響因素〔11〕，目前，研究miR-143與宮頸癌疾病的資料并不豐富，本研究探討miR-143在宮頸癌大鼠模型血清中的表達及其對于腫瘤生長的相關影響機制。

1 材料與方法

1.1主要材料及儀器 4～6周齡裸鼠(中科院上海實驗動物中心)、人宮頸癌Hela細胞株(上海北諾生物科技有限公司)、Trizol試劑盒(上海恒雅生物科技有限公司)、質粒提取試劑盒(廣州伯信生物科技有限公司)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒(上海素爾生物科技有限公司)、CD31抗體、胰島素受體底物(IRS)-1抗體、胰島素樣生長因子(IGF)-1受體(R)抗體、低氧誘導因子(HIF)-1α抗體(賽默飛世爾科技有限公司)、伯恩固定液(上海如吉生物科技發展有限公司)、恒溫培養箱(上海錦玟儀器設備有限公司)、聚合酶鏈反應(PCR)儀、電泳儀(南京庚辰科學儀器有限公司)等。

1.2宮頸癌大鼠模型制備 將人宮頸癌Hela細胞株于37℃、5%CO2培養箱中培養至對數期，對培養的細胞行胰酶消化，再放入含胎牛血清的基礎培養基上停止消化，再通過離心、洗滌操作將細胞調至100個/ml，向建模大鼠腋下注射0.5 ml的Hela細胞懸液，統一正常飼養7 d后若發生明顯腫瘤結節則代表宮頸癌大鼠模型成功建立，本研究建立宮頸癌模型大鼠10只，另外10只為不做處理的對照組。

1.3定量(q)PCR檢測miR-143水平 建模后14 d抽取兩組大鼠靜脈血液，細胞裂解處理后進行Trizol提取細胞總RNA，再進行RNA的逆轉錄反應，設置U6為內參基因，根據miR-143 qPCR試劑盒說明進行PCR擴增，測定miR-143的相對水平。引物序列：U6正義鏈：5′-GCTGTAGTACTAGTACCGG-3′，反義鏈：5′-CAATGTAAATGTTGGTCAAGTA-3′，220 bp；miR-143正義鏈：5′-AGTAGTATCCCGTAATATAGG-5′，反義鏈：5′-TAAGGTTCTCTCGGATATCATGTA-3′，251 bp。

1.4控制miR-143表達的裸鼠成瘤試驗 將周齡為4～6 w的裸鼠20只隨機均分為對照(miR-SCR)組與miR-143過表達(miR-143)組。消化穩定細胞株Hela/miR-143和Hela/miR-SCR，進行細胞計數，將4×106個細胞稀釋至150 μl，再進行裸鼠兩側皮下注射。常規飼養12 d后裸鼠皮下腫瘤肉眼可見，供后續進行相關試驗操作和指標的檢測。

1.5腫瘤相關指標檢測 ①裸鼠建模24 d后將宮頸癌腫瘤剝離，拍照并測量對照組和miR-143組的腫瘤長、寬、高，計算體積；②對兩組腫瘤稱重，記錄重量；③從建模飼養的12 d起隔2 d記錄腫瘤體積并繪制兩組的腫瘤體積上升曲線，比較組間差異；④Western印跡檢測兩組裸鼠體內宮頸癌腫瘤組織中能夠反映腫瘤增殖情況的生物指標增殖細胞核抗原(PCNA)、反映腫瘤微血管形成的生物指標CD31抗體及IRS-1、IGF-1R蛋白、HIF-1α的表達，并進行比較；⑤qPCR檢測兩組宮頸癌組織中血管內皮生長因子(VEGF)mRNA的表達水平；⑥將兩組腫瘤細胞用伯恩固定液進行固定，然后行常規免疫組織化學切片操作，于顯微鏡下觀察各組腫瘤組織中的新生血管數，并進行比較。

1.6雙熒光素酶報告試驗預測miR-143靶基因 通過PicTar、FindTar等生物信息學軟件對miR-143的靶基因進行預測及篩選，篩選出IRS-1和IGF-1R與miR-143有較高的匹配度，構建野生型(WT)質粒IRS-1-WT及IGF-1R-WT，和含miR-143序列突變的突變型(MUT)質粒IRS-1-MUT及IGF-1R-MUT，通過雙報告熒光素酶試驗分析其與miR-143的相互作用，具體操作按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書進行。

1.7統計學處理 采用SPSS19.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1miR-143在宮頸癌大鼠血清中表達 miR-143在宮頸癌模型組血清中表達(0.07±0.01)顯著低于對照組〔(1.03±0.05)；t=15.560,P<0.05〕。

2.2miR-143對腫瘤生長的影響 miR-143組腫瘤從外觀來看也較miR-SCR組顯著變小，見圖1；與miR-SCR組相比，miR-143組腫瘤的長、寬、高及體積均顯著減小(均P<0.01)，見表1；miR-143組腫瘤的重量〔(0.15±0.02)g〕顯著少于miR-SCR組〔(0.45±0.03)g；t=44.577，P<0.05〕；從對腫瘤生長體積的定期監測來看，miR-143組腫瘤的生長較miR-SCR組顯著變慢(P<0.05)，且隨天數的增加兩組體積差逐漸增大(P<0.001)，見表2；miR-143組腫瘤中增殖細胞核抗原(PCNA)表達(0.47±0.10)較miR-SCR組(0.79±0.12)顯著降低(t=9.447，P<0.05)，見圖2。

2.3miR-143對腫瘤新血管生成的影響 免疫組化結果顯示，miR-143組腫瘤組織中的微血管較miR-SCR組顯著減少，見圖3；miR-143組腫瘤組織中的CD31抗體的表達(30.31±1.21)較miR-SCR組(70.33±2.45)顯著降低(t=79.196，P<0.05)。

2.4miR-143靶基因預測 生物信息學軟件預測到IRS-1和IGF-1R與miR-143有相匹配的基因序列，見圖4。WT預測基因序列及含miR-143靶向序列MUT預測基因序列構建正確，見圖5。miR-143組IRS-1-WT及IGF-1R-WT熒光素酶活性較miR-SCR組顯著降低(P<0.05)；miR-143組IRS-1-MUT及IGF-1R-MUT熒光素酶活性與miR-SCR組無統計學差異(P>0.05)，見表3。

圖1 miR-143對腫瘤形態的影響

表1 miR-143對腫瘤體積的影響

表2 兩組不同時間點腫瘤體積比較

圖2 miR-143對腫瘤PCNA表達水平的影響

圖3 免疫組化顯微鏡下觀察兩組微血管數量(×400)

圖4 miR-143靶基因預測

圖5 WT及MUT報告基因測序

表3 miR-143對靶點報告基因熒光素酶活性影響

2.5miR-143對靶基因的調控 Western印跡檢測宮頸癌組織中的IRS-1、IGF-1R蛋白水平發現，miR-143組的IRS-1、IGF-1R蛋白表達(0.63±0.18、0.85±0.33)較miR-SCR組(1.22±0.23、1.37±0.27)顯著降低(t=16.799，P=0.000；t=13.625，P=0.001)，miR-143組HIF-1α蛋白表達(0.52±0.03)較miR-SCR組(1.24±0.05)顯著降低(t=11.567，P=0.003)，miR-143組VEGF mRNA表達水平(0.34±0.02)較miR-SCR組(1.06±0.14)顯著降低(t=19.544，P=0.000)，見圖6、圖7。

圖6 兩組IRS-1、IGF-1R、HIF-1α蛋白表達

圖7 兩組VEGF mRNA表達

3 討 論

近年miRNA在腫瘤疾病中的研究取得了很多突破性發現，同種miRNA在不同腫瘤疾病中發揮的作用不完全相同，涉及調控機制存在很大差異〔12〕。研究miRNA對腫瘤疾病的作用、表達的高低、其調控疾病過程中靶基因的確定對判斷該miRNA的促癌或抗癌作用十分必要，這也為腫瘤早期的臨床診斷及治療靶點提供了關鍵參考。研究發現，miR-143在包括膀胱癌、胃癌和乳腺癌等眾多腫瘤疾病中出現異常表達現象，推測與其對腫瘤的相關生物學調控有關〔13～15〕。研究指出IGF-1R作為一類與細胞生長及胚胎發育相關的細胞因子在很多類型細胞中都有表達，并且在腫瘤疾病中，IGF-1R作為重要的促癌因子促進癌細胞增殖及機體正常細胞發生癌變〔16～18〕。IRS-1能幫助胞內信號傳導，在多種腫瘤中的表達顯著上升，在腫瘤形成、增殖、侵襲等惡性生物學行為中扮演重要角色，是腫瘤標志物之一〔19〕。而IGF-1R/IRS-1下游調控的低氧誘導分子HIF-1α和VEGF能通過進一步促進腫瘤微血管的生成推進腫瘤疾病的進程〔20〕。

本研究中miR-143宮頸癌大鼠模型在很好地模擬miR-143體內功能的同時,還能夠進一步推進臨床試用新型治療靶點的進程。進一步驗證了miR-143能夠有效抑制模型大鼠體內宮頸癌腫瘤的生長，且IRS-1、IGF-1R是miR-143的靶向調控基因。本研究首先確定了miR-143于宮頸癌大鼠模型中低表達，進一步構建miR-143過表達的裸鼠模型，確定其表達對腫瘤生長的影響及相關機制，推進了臨床治療宮頸癌疾病試用新型治療靶點的進程，由于其中涉及分子及通路復雜，更加全面的研究需要進行多次的多樣化的試驗設計和理論討論。

綜上，miR-143在宮頸癌大鼠血清中顯著低表達，高表達的miR-143抑制腫瘤的生長，其調控機制可能與miR-143抑制腫瘤微血管生成及抑制促腫瘤生長的IRS-1、IGF-1R表達從而抑制其下游HIF-1α、VEGF的表達有關。