老年皮膚基底細胞癌患者miR-451、TBX1表達及其與預后的相關性

楊文紅 丁紅煒 王魏 王林娜 郭玲

(1衡水市人民醫(yī)院皮膚科，河北 衡水 053000；2山東大學第二醫(yī)院整形外科；3衡水市人民醫(yī)院病理科)

皮膚基底細胞癌(BCC)是皮膚病理學中常見的非黑色素皮膚瘤，多發(fā)生于老年人，研究報道，BCC的患病率和發(fā)病率逐年不斷上升，且發(fā)病人群趨于年輕化，給患者和醫(yī)療系統帶來較大負擔〔1,2〕。微小RNA(miRNA)是由22個核苷酸組成的單鏈非編碼小分子RNA，與其靶基因結合參與調節(jié)基因的轉錄和翻譯，與細胞發(fā)育、分化、遷移等多種生物學過程相關，miRNA的異常表達與免疫應答、神經性疾病、癌癥等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關〔3～5〕。研究發(fā)現，miR-451在非小細胞肺癌中異常表達，是一種新型腫瘤抑制因子〔6〕。T結構域轉錄因子(TBX)1是一種轉錄因子，在組織發(fā)育中起重要作用，研究顯示，miR-451可靶向作用于TBX1在BCC發(fā)生中起關鍵作用〔7〕，但關于miR-451、TBX1在BCC預后中作用的報道較少。本研究通過檢測miR-451、TBX1在BCC組織中的表達，探討其與預后的相關性，以期為BCC的臨床診治提供一定理論依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2013年8月至2018年3月于衡水市人民醫(yī)院皮膚科經手術治療的老年BCC患者85例，其中男44例，女41例，平均年齡(67.85±5.62)歲，根據其臨床表現分為：結節(jié)潰瘍型組38例，色素型組27例，淺表型組15例，硬斑病樣或纖維化型組5例，各組年齡、性別、體重指數(BMI)比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組一般資料比較

納入標準：(1)患者年齡≥60歲；(2)組織病理學活檢確診為BCC；(3)患者的病理資料及隨訪資料完整；(4)無化學治療史。排除標準：(1)患有免疫系統疾病患者；(2)患有認知障礙和溝通障礙患者；(3)肝、腎功能不全患者。本研究獲得衡水市人民醫(yī)院倫理委員會審查批準，且受試者均簽訂知情同意書。

1.2主要試劑及儀器 Trizol提取試劑盒(批號：RN0401)購自北京艾德萊生物科技公司；逆轉錄試劑盒(批號：K1622)購自美國Fermentas公司；AceQ qPCR SYBR Green Master Mix實時熒光定量PCR試劑盒(批號：Q111-02)購自南京諾唯贊生物科技有限公司；TBX1抗體(批號：PAB17338)購自艾美捷科技有限公司；鼠抗人二抗(批號：054920)購自美國Invitrogen公司；實時熒光定量PCR儀(型號：CFX384Touch)購自美國伯樂公司；光學顯微鏡(型號：DM2700)購自德國徠卡公司。實時熒光定量PCR(RT-qPCR)所需引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3方法

1.3.1RT-qPCR檢測BCC患者組織標本中miR-451、TBX1 mRNA表達 收集患者手術切取活體組織標本，用Trizol法提取組織總RNA，反轉錄為cDNA，用RT-qPCR檢測BCC患者組織標本中miR-451、TBX1 mRNA表達。miR-451上游引物：5′-AAAAAAACCGTTACCGA-3′，下游引物：5′-GTTACCATTACTGAGTT-3′；TBX1上游引物：5′-CTGACCAATAACCTGCTGGATGA-3′，下游引物：5′-GGCTGATATCTGTGCATGGAGTT-3′；U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACAGAC-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；GAPDH上游引物：5′-GGAGTCCACTGGCGTCTTCA-3′，下游引物：5′-GGGGTGCTAAGCAGTTGGTG-3′。配制20 μl反應體系，反應條件：預變性95℃ 30 s；變性95℃ 5 s，退火60℃ 30 s，延伸70℃ 10 s，共35個循環(huán)。以U6、GAPDH為內參，用2-ΔΔCt計算miR-451、TBX1 mRNA相對表達量。

1.3.2免疫組化檢測TBX1在BCC組織中表達 將患者手術切取活體組織，用10%甲醛固定做常規(guī)石蠟切片，然后進行脫蠟水化、水浴加熱修復抗原、孵育一抗(TBX1抗體，1∶500)，4℃過夜，次日，滴加二抗，室溫孵育1 h，二氨基聯苯胺(DAB)染色、水洗、蘇木素復染、脫水、透明、中性樹膠封片，用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。

1.3.3免疫組化結果判定 TBX1免疫組化結果判定：細胞核中出現黃色或棕黃色則為TBX1陽性，在顯微鏡下隨機選取5個視野，根據Fromowitz方法〔8〕進行評分，陽性細胞所占百分比：<5% 0分，5%～25% 1分，26%～50% 2分，51%～75% 3分，>75% 4分；染色強度：無著色0分，淺黃色1分，黃色2分，棕黃色3分。陽性細胞所占百分比得分與染色強度得分總和：≥2分為陽性，<2分為陰性。

1.3.4隨訪 患者術后，前3個月每個月復查1次，4～12月每3個月復查1次，1年后主要以電話隨訪和登門拜訪兩種隨訪方式收集患者資料，隨訪截止時間2020年1月，平均隨訪(55.85±6.50)個月。

1.4統計學處理 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗、χ2檢驗、Pearson相關分析；繪制Kaplan-Meier生存曲線，并進行Log-rank檢驗。

2 結 果

2.1各組BCC組織中miR-451、TBX1 mRNA表達水平 與結節(jié)潰瘍型組相比，色素型組、淺表型組、硬斑病樣或纖維化型組組織中miR-451表達水平顯著降低(P<0.05)，TBX1 mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)；與色素型組、淺表型組相比，硬斑病樣或纖維化型組miR-451表達水平顯著降低(P<0.05)，TBX1 mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)。見表2。

2.2各組BCC組織中TBX1陽性表達 與結節(jié)潰瘍型組〔12例(31.58%)〕相比，TBX1陽性表達率在色素型組〔17例(62.96%)〕、淺表型組〔10例(66.67%)〕、硬斑病樣或纖維化型組〔4例(80.00%)〕BCC組織中顯著增加(P<0.05)。

2.3miR-451、TBX1表達與BCC患者臨床病理特征的關系 根據miR-451在BCC組織中表達水平平均值分為高表達組(≥0.91，43例)，低表達組(<0.91，42例)，miR-451、TBX1在BCC組織中的表達與患者年齡、皮損直徑無關(P>0.05)，與組織病理分型、轉移情況顯著相關(P<0.05)。見表3。

表2 各組BCC組織中miR-451表達水平比較

1)與結節(jié)潰瘍型組相比，2)與硬斑病樣或纖維化型組相比:均P<0.05

表3 miR-451、TBX1表達與BCC患者臨床病理特征的關系〔n(%)〕

2.4BCC組織中miR-451與TBX1表達的關系 BCC組織中miR-451與TBX1表達呈負相關(r=-0.618，P<0.05)。見圖1。

2.5miR-451、TBX1在BCC組織中表達與患者預后的關系 隨訪期間72例未出現復發(fā)或轉移，患者無病生存率為84.71%。miR-451低表達患者無病生存率〔80.95%(34/42)〕顯著低于miR-451高表達患者〔88.37%(38/43)，P=0.044〕，TBX1陽性表達患者無病生存率〔83.72%(36/43)〕顯著低于TBX1陰性表達患者〔85.71%(36/42)，P=0.042〕。見圖2。

圖1 BCC組織中miR-451與TBX1表達的關系

圖2 不同miR-451、TBX1表達BCC患者生存曲線

3 討 論

BCC多發(fā)生在面部、頭皮等曝光部位，BCC具有生長緩慢、局部浸潤性等特征，因此BCC患者發(fā)生轉移的較少，但其組織分型較多，根據其表型表現和組織病理學分為低風險型和高風險型，高風險型的BCC具有較強的浸潤性和侵略性，在進行手術治療后引起并發(fā)癥，即愈合缺陷，植皮失敗和傷口感染的風險較高〔9,10〕。研究表明，分子靶向治療技術在BCC臨床治療中發(fā)揮重要作用〔11,12〕，因此，在分子水平研究BCC發(fā)病機制，有利于臨床治療BCC新型靶向療法的發(fā)展和預后監(jiān)測。

miRNA可以調節(jié)轉錄后相關蛋白的表達并調節(jié)腫瘤的發(fā)展，崔勝金等〔13〕研究顯示，miR-451在非小細胞肺癌中低表達，與腫瘤大小、淋巴結轉移和TNM分期顯著相關，可以作非小細胞肺癌早期診斷的候選標志物。高瑤等〔14〕研究顯示miR-451可以減少卵巢癌細胞增殖，是一種可以預測上皮性卵巢癌患者預后不良的獨立因素。包佑根等〔15〕研究顯示miRNA-451在膀胱癌組織低表達，且其表達水平與膀胱癌臨床病理特征及癌細胞轉移潛能密切相關，是膀胱癌潛在的調控基因。以上研究均表明，miR-451的異常表達與多種腫瘤疾病發(fā)生相關，對其診斷、預后有重要作用。本研究提示miR-451表達異常與BCC的發(fā)生發(fā)展有關，且其表達水平可能與其病理分型有關，本研究結果提示，miR-451在BCC組織中的表達與患者組織病理分型、轉移情況顯著相關。

TBX1屬于T-BOX家族，可以調節(jié)細胞生長或組織發(fā)育〔16,17〕，TBX1的異常表達與遺傳性疾病、心血管疾病、腫瘤等疾病發(fā)生相關〔18～20〕，Verdelli等〔21〕研究顯示TBX1在成人甲狀旁腺細胞中表達，在甲狀旁腺腫瘤中表達失調，其中TBX1缺乏可能會導致甲狀旁腺腫瘤的低增殖性。本研究提示TBX1表達與BCC的發(fā)生發(fā)展密切相關，進一步研究分析發(fā)現，TBX1在BCC組織中的表達與患者組織病理分型、轉移情況顯著相關。Sun等〔7〕研究顯示，TBX1在BCC腫瘤組織中顯著上調，miR-451a表達水平與TBX1表達水平相反。本研究結果顯示，BCC組織中miR-451、TBX1表達呈負相關。徐品等〔22〕研究顯示，miR-451可以作為診斷肝癌和指示預后的生物標志物。本研究進一步Kaplan-Meier生存曲線結果提示BCC組織中miR-451、TBX1表達水平可作為預測患者預后的分子標志物。

綜上所述，腫瘤組織中miR-451低表達和TBX1高表達與BCC的發(fā)生發(fā)展及預后密切相關，可能成為BCC臨床病理分型及預后評估的輔助指標。但由于樣本數量較少，需要擴大樣本量進一步驗證。