陳 雪,馮文榮,周立水,丁秀芳,梁 猛,唐永凱,3*
(1上海海洋大學水產與生命學院,上海 201306;2中國水產科學研究院淡水漁業研究中心/農業農村部淡水漁業與種質資源利用重點實驗室,江蘇無錫 214081;3南京農業大學無錫漁業學院,江蘇無錫 214081)
【研究意義】呼吸和排泄是動物能量代謝的主要組成部分,其變化能反映動物機體的生理狀態及其對環境變化的響應。耗氧率和排氨率是評價水產動物呼吸和排泄的最常見指標,可間接反映呼吸代謝規律和生理狀態,對水產動物能量代謝研究及養殖環境調控具有重要指導作用(馮雪等,2012)。溫度和pH是影響水生動物生存、生長和生理狀態的主要環境因子(葉樂等,2015;徐連偉等,2018;韓慶等,2021)。因此,探究中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)幼蟹在不同環境條件下的呼吸代謝規律,對提高幼蟹養殖存活率具有重要意義。【前人研究進展】環境溫度可顯著影響水產動物呼吸代謝水平和生理調節機制,過高或過低的溫度均會抑制其生長發育,降低存活率(李青和陳永祥,2019)。已有研究表明,溫度變化會影響太平洋牡蠣(Crassostrea gigasThun‐berg)(Bougrier et al.,1995)、巴拿馬珠母貝(Pincta‐da mazatlanica)(Saucedo et al.,2004)、蝦夷扇貝(Datinopecten yessoensis)(徐東等,2010)、三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)(戴超等,2014)、中華原鉤蝦(Eogammarus sinensis)(曹善茂等,2015)、菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)(Nie et al.,2017)及九孔鮑(Haliotis diversicolor supertexta)(王崇懿等,2020)等水產動物的耗氧率和排氨率,在適宜溫度范圍內,溫度越高,水產動物的代謝水平越高,耗氧率和排氨率也隨之升高;當超過或低于一定溫度后,其生理代謝水平紊亂,機體進入麻痹甚至停止的狀態,耗氧率和排氨率隨之下降。此外,不同水平的pH可影響水產動物的呼吸代謝和能量供給方式。水產動物對水體pH也有一定的適應范圍,當水體pH超過或低于適宜范圍時,則影響水產動物的新陳代謝、生長發育及呼吸等一系列生理過程,甚至引起病變或死亡,如pH變化會導致中國龍蝦(Panulirus stimpsoni)(梁華芳等,2011)、波紋龍蝦(P.homarusLinnaeus)(梁華芳等,2012)、中華原鉤蝦(曹善茂等,2015)、中華小長臂蝦(Palaemonetes sinensis)(姜宏波等,2017)及大竹蟶(Solen grandis)(張雨等,2021)等水產動物的耗氧率和排氨率發生變化。針對中華絨螯蟹的研究,鄭曙明和李代金(1989)對其幼蟹耗氧率進行測定,鄒恩民等(1995)觀察了中華絨螯蟹在不同溫度下的呼吸率變化。不適宜的溫度同樣會抑制中華絨螯蟹的生長、攝食和蛻皮(洪美玲等,2007;Yuan et al.,2017);在過酸或過堿的pH脅迫下,中華絨螯蟹的生長收到顯著抑制(黃志鵬,2018),尤其是高pH脅迫易引起中華絨螯蟹氧化應激反應(龔志等,2015)。【本研究切入點】中華絨螯蟹俗稱河蟹、大閘蟹等,隸屬于節肢動物門(Arthropo‐da)十足目(Decapoda)方蟹科(Grapsidae)弓腿亞科(Varuninae)絨螯蟹屬(Eriocheir),是我國重要的淡水養殖品種(張本銘等,2000),其生長發育、能量代謝和生理狀態等極易受環境因子(溫度、鹽度和pH等)的影響。雖然已有研究聚焦于溫度和pH對中華絨螯蟹的影響,但關于不同規格中華絨螯蟹在不同溫度和pH下的呼吸代謝變化規律尚不清楚。【擬解決的關鍵問題】探討溫度和pH對中華絨螯蟹幼蟹耗氧率、排氨率及窒息點的影響,明確中華絨螯蟹在不同環境條件下的呼吸代謝規律,為其幼蟹養殖條件的優化和種苗繁育提供參考依據。
中華絨螯蟹幼蟹由中國水產科學研究院淡水漁業中心陽澄湖蝦蟹綠色養殖基地提供。幼蟹在實驗室玻璃缸內暫養1周,使其適應小水體環境。暫養期間不間斷充氣增氧,溶解氧濃度保持在7.00 mg/L以上,暫養溫度為(15±2)℃,與蟹塘溫度相近,pH 8.0±0.2。每天上午投喂商品配合飼料,換水量為1/3。正式試驗前1 d停止投喂,選擇處于蛻皮間期的健康個體,根據體質量分成3組(表1),分別為:大規格組(L)21.68±3.58 g,中規格組(M)11.31±0.29 g,小規格組(S)5.84±0.33 g。

表1 供試中華絨螯蟹幼蟹的生物學指標Table 1 Biological indexes of juvenile E.sinensis tested
(1)溫度試驗設5個不同溫度梯度(10、15、20、25和30 ℃),采用控溫棒進行緩慢加溫或冰塊緩慢降溫的方法調節水溫,待水溫穩定后(±0.5 ℃),使幼蟹在相應溫度下適應2 h后(L組4只,M組9只,S組16只)再進行試驗。水體pH 8.0±0.2。
(2)pH試驗設4個不同pH梯度(pH 6.0、pH 7.0、pH 8.0和pH 9.0),分別以HCl或NaOH調節水體pH,將pH調試至相應梯度(±0.2),使幼蟹放適應2 h后再進行試驗。水體溫度(15±2)℃。
1.3.1 耗氧率測定 利用Loligo?Systems水生無脊椎動物呼吸代謝測量系統,配合FireSting O2裝置,采用密閉系統進行溶解氧濃度測定。呼吸室為直徑10 cm、長20 cm的透明容器,呼吸室連接循環水泵,保證呼吸室內水充分混合。將適應暫養2 h的幼蟹放入呼吸室,呼吸室放入少量人工水草,為幼蟹提供躲藏場所。試驗期間將呼吸室密封,通過O2探頭每10 min測量并記錄溶解氧濃度。
1.3.2 排氨率測定 試驗持續30 min。試驗前后在呼吸室分別取50 mL水樣,采用納氏試劑分光光度法進行氨氮含量測定。
1.3.3 窒息點測定 使用相同裝置,幼蟹置于密閉呼吸室,每10 min測量并記錄溶解氧濃度,直至幼蟹出現不再爬動、附肢伸直僵硬、腹部向上等癥狀,且實時溶解氧濃度30 min內變化微小,此時的溶解氧濃度即為窒息點。
耗氧率R0[mg/(g·h)]=[(DO0-DOt)×V]/(W×T)
排氨率RN[mg/(g·h)]=[(Nt-N0)×V]/(W×T)
氨商AQ=RN/R0
能量代謝率Rm(J/g)=k×R0
式中:DO0為試驗開始時呼吸室中的溶解氧濃度(mg/L),DOt為試驗結束時呼吸室中的溶解氧濃度(mg/L),V為呼吸室體積(L),W為試驗開始前中華絨螯蟹幼蟹的體質量(g);T為試驗持續時間(h),N0為試驗開始時呼吸室中的氨氮濃度(mg/L),Nt為試驗結束時呼吸室中的氨氮濃度(mg/L),k為氧卡系數(13.56 J/mg)。
試驗數據采用SPSS 23.0分別進行單因素和雙因素方差分析,通過HSD多重比較檢驗組間差異顯著性,并以GraphPad Prism 8制圖。
2.1.1 溫度對中華絨螯蟹幼蟹耗氧率的影響 如圖1-A所示,隨著溫度的升高,L組、M組和S組的幼蟹耗氧率均呈升高趨勢,且耗氧率隨幼蟹體質量的增加而降低。L組幼蟹的耗氧率從10 ℃到20 ℃呈顯著升高趨勢(P<0.05,下同),而20 ℃到30 ℃無顯著變化(P>0.05,下同);M組幼蟹的耗氧率從10 ℃到20 ℃呈顯著升高趨勢,20 ℃到25 ℃無顯著變化,至30 ℃時又顯著升高;S組幼蟹的耗氧率從10 ℃到30 ℃均呈顯著升高趨勢。在10和15 ℃下,S組幼蟹的耗氧率顯著高于L組,M組與S組和L組的差異均不顯著;在30 ℃下,幼蟹耗氧率表現為L組 2.1.2 溫度對中華絨螯蟹幼蟹排氨率的影響 如圖1-B所示,幼蟹排氨率隨溫度的升高呈不斷上升趨勢。L組幼蟹的排氨率在10~20 ℃間無顯著差異,從25 ℃到30 ℃則呈顯著升高趨勢;S組和M組幼蟹的排氨率從10 ℃到30 ℃均呈顯著升高趨勢。在10 ℃下,幼蟹排氨率表現為L組>M組>S組,組間差異顯著;在15和20 ℃下,S組幼蟹的排氨率顯著高于L組和M組;在25和30 ℃下,幼蟹排氨率則表現為L組 圖1 溫度對不同規格中華絨螯蟹幼蟹耗氧率和排氨率的影響Fig.1 Effects of temperature on oxygen consumption rate and ammonia excretion rate of juvenile E.sinensis with different sizes 2.1.3 回歸分析結果 在10~30 ℃范圍內,中華絨螯蟹幼蟹的耗氧率與體質量呈負相關,其回歸方程為R0=a1Wb1(a為代謝水平,b為體質量指數)。在10 ℃下,幼蟹的排氨率與體質量呈正相關,在15~30 ℃下,幼蟹的排氨率與體質量呈負相關,其回歸方程為RN=a2Wb2。其中,a1取值范圍為0.1901~1.3525,b1取值范圍為-0.470~-0.091,a2取值范圍為0.6517~31.534,b2取值范圍為-0.504~0.5232(表2)。 表2 不同溫度下體質量對中華絨螯蟹幼蟹耗氧率和排氨率的回歸分析結果Table 2 Regression analysis results of body mass on oxygen consumption rate and ammonia excretion rate of juvenile E.si‐nensis under different temperatures 2.2.1 pH對中華絨螯蟹幼蟹耗氧率的影響 如圖2-A所示,在pH 6.0~9.0范圍內,隨著pH的升高,不同規格中華絨螯蟹幼蟹的耗氧率均呈先降低后升高的變化趨勢。在pH 7.0和pH 8.0處理下,L組和M組幼蟹的耗氧率無顯著差異,但經pH 9.0處理后顯著升高。S組幼蟹的耗氧率在pH 7.0和pH 8.0處理下顯著低于pH 6.0和pH 9.0處理。此外,在pH 6.0處理下,S組幼蟹的耗氧率顯著高于M組和L組;在其他pH處理下,S組和M組間無顯著差異。 2.2.2 pH對中華絨螯蟹幼蟹排氨率的影響 如圖2-B所示,在pH 6.0~9.0范圍內,S組幼蟹的排氨率顯著高于L組和M組,且在pH 8.0和pH 9.0處理下的排氨率較在pH 6.0和pH 7.0處理下顯著降低。L組和M組幼蟹的排氨率在pH 6.0~9.0范圍內變化較小,M組在pH 8.0處理下的排氨率有所下降。在pH 9.0處理下,不同規格中華絨螯蟹幼蟹的排氨率存在顯著差異,表現為L組 圖2 pH對不同規格中華絨螯蟹幼蟹耗氧率和排氨率的影響Fig.2 Effects of pH on oxygen consumption rate and ammonia excretion rate of juvenile E.sinensis with different sizes 2.2.3 回歸分析結果 在pH 6.0~9.0范圍內,中華絨螯蟹幼蟹的耗氧率和排氨率與體質量均呈負相關,對應的回歸方程分別為R0=a3Wb3和RN=a4Wb4。其中,a3取值范圍為0.3125~0.7483,b3取值范圍為-0.352~-0.004,a4取值范圍為6.6507~8.5568,b4取值范圍為-0.324~-0.266(表3)。 表3 不同pH下體質量對中華絨螯蟹幼蟹耗氧率和排氨率的回歸分析結果Table 3 Regression results of body mass on oxygen consump‐tion rate and ammonia excretion rate of juvenile E.sinensis un‐der different pH 2.3.1 溫度對中華絨螯蟹幼蟹窒息點的影響 如圖3-A所示,不同規格中華絨螯蟹幼蟹的窒息點均以10 ℃時最高,且顯著高于15~30 ℃下的窒息點。L組幼蟹的窒息點在15 ℃和20 ℃、20 ℃和30 ℃時無顯著差異,以25 ℃時的窒息點最低,顯著低于其他溫度處理;M組幼蟹的窒息點在15 ℃和30 ℃間也無顯著差異,也是以25 ℃時的窒息點顯著低于其他溫度處理;S組幼蟹的窒息點隨溫度的升高呈逐漸下降趨勢,除了在25 ℃和30 ℃間無顯著差異外,其他溫度處理間均存在顯著差異。 2.3.2 pH對中華絨螯蟹幼蟹窒息點的影響 如圖3-B所示,不同規格中華絨螯蟹幼蟹的窒息點均隨pH的升高呈先降低后升高的變化趨勢。在L組和M組中,其幼蟹窒息點在任意2個pH處理間均存在顯著差異;S組幼蟹的窒息點在pH 6.0和pH 9.0處理間無顯著差異,但二者顯著高于其他pH處理。此外,S組幼蟹的窒息點在不同pH處理下均顯著高于L組和M組,在pH 9.0處理下表現為L組 圖3 溫度和pH對不同規格中華絨螯蟹幼蟹窒息點的影響Fig.3 Effects of temperature and pH on asphyxiation point of juvenile E.sinensis with different sizes 2.4.1 溫度對中華絨螯蟹幼蟹氨商的影響 如圖4-A所示,不同規格中華絨螯蟹幼蟹的氨商在10~30 ℃范圍內均呈先降低后升高的變化趨勢。L組幼蟹的氨商在15 ℃和25 ℃間無顯著差異,在其他溫度處理下則存在顯著差異;M組幼蟹的氨商在15 ℃和20 ℃、25 ℃和30 ℃間均無顯著差異,以20 ℃下的氨商最低;S組幼蟹以在30 ℃下的氨商最高,顯著高于其他溫度處理,而在其他溫度處理下的氨商差異均不顯著。此外,在10 ℃下幼蟹的氨商排序為S組 2.4.2 pH對中華絨螯蟹幼蟹氨商的影響 如圖4-B所示,隨pH的升高,不同規格中華絨螯蟹幼蟹的氨商均呈先升高后降低的變化趨勢。L組幼蟹的氨商在pH 6.0~8.0間無顯著差異,在pH 9.0下顯著低于其他pH處理組。M組和S組幼蟹的氨商在pH 7.0和pH 8.0處理下均呈升高趨勢,且二者間無顯著差異,在pH 9.0處理下則顯著降低。此外,在pH 7.0和pH 8.0處理下S組幼蟹的氨商顯著高于M組和L組。 圖4 溫度和pH對不同規格中華絨螯蟹幼蟹氨商的影響Fig.4 Effects of temperature and pH on ammonia quotient of juvenile E.sinensis with different sizes 2.5.1 溫度對中華絨螯蟹幼蟹能量代謝率的影響如圖5-A所示,隨著溫度的升高,不同規格中華絨螯蟹幼蟹的能量代謝率均呈上升趨勢。幼蟹在10 ℃下的能量代謝率最低,而30 ℃下的能量代謝率最高。在10、15、20和25 ℃下,M組和L組幼蟹的能量代謝率無顯著差異,而S組幼蟹的能量代謝率顯著高于M組和L組。在30 ℃下,L組、M組和S組幼蟹的能量代謝率排序為S組>M組>L組,且組間存在顯著差異。 圖5 溫度和pH對不同規格中華絨螯蟹幼蟹能量代謝率的影響Fig.5 Effects of temperature and pH on energy metabolic rate of juvenile E.sinensis with different sizes 2.5.2 pH對中華絨螯蟹幼蟹能量代謝率的影響如圖5-B所示,隨著pH的升高,不同規格中華絨螯蟹幼蟹的能量代謝率呈先降低后升高的變化趨勢,均在pH 9.0處理下達最高值。在pH 6.0處理下,幼蟹的能量代謝率排序為S組>M組>L組,組間差異顯著;在pH 8.0和pH 9.0處理下,不同規格中華絨螯蟹幼蟹間的能量代謝率均無顯著差異。 溫度是影響蝦蟹呼吸代謝最重要的環境因子(林小濤等,2000)。在適宜的溫度范圍內,隨著溫度的升高,蝦蟹體內代謝相關酶的活性增強,代謝速率加快,導致耗氧率和排氨率升高。高于或低于適宜溫度時,均會抑制機體代謝相關酶活性,影響機體的生理功能,致使能量代謝率降低,即耗氧率和排氨率降低(羅嘉俊等,2020)。已有研究表明,羅氏沼蝦(Mucrobrachium rosenbergii)幼蝦的耗氧率和氨氮、尿素氮、有機氮和總氮排泄在17~32 ℃范圍內隨溫度的升高而升高(Chen and Kou,1996);三疣梭子蟹的耗氧率和排氨率隨溫度的升高而升高,在27 ℃時達最大值(戴超等,2014);中華原鉤蝦的耗氧率和排氨率隨溫度的升高整體上呈上升趨勢(曹善茂等,2015)。本研究結果表明,隨著溫度的上升,中華絨螯蟹幼蟹的耗氧率、排氨率和能量代謝率均呈上升趨勢,說明溫度升高加快其呼吸代謝;此外,耗氧率在20~25 ℃間的升幅與其他溫度相比較小,排氨率在15~20 ℃間的升幅較其他溫度變化相比較小,而能量代謝率20~25 ℃間的升幅較其他溫度相對較小,表明中華絨螯蟹在適宜的溫度范圍內其呼吸代謝相對穩定。在10 ℃或30 ℃下,中華絨螯蟹幼蟹的耗氧率和排氨率與20 ℃下的存在顯著差異,表明10 ℃或30 ℃不適合中華絨螯蟹幼蟹生長發育,與李青和陳永祥(2019)的研究結果一致,即環境溫度過高或過低均會影響蝦蟹的代謝、生長、蛻殼和存活。綜合考慮溫度、氨商和能量代謝率對中華絨螯蟹幼蟹耗氧率和排氨率的影響,可確定20~25 ℃更加適宜幼蟹生長,與幼蟹在生產養殖中得到的最適溫度吻合。 甲殼類動物對環境pH較敏感。環境pH變化會影響甲殼類動物的存活率、離子平衡、蛻皮頻率、性成熟、繁殖及體質量增長等(Allan and Maguire,1992;Chen and Chen,2003)。當環境pH高于或低于某一范圍時,會改變甲殼類生物的呼吸活動,影響其從外界吸取氧的能力,進而影響到耗氧率和排氨率(馮雪等,2012)。不同水產動物在不同pH下的呼吸代謝規律各不相同。朱愛意等(2007)研究發現,當pH適合時褐菖鲉耗氧率較低,超出pH適合范圍后褐菖鲉通過改變機體代謝狀況以適應環境pH,其耗氧率升高;梁華芳等(2012)研究表明,波紋龍蝦的耗氧率隨著pH的升高而降低;曹善茂等(2015)研究發現中華原鉤蝦耗氧率和排氨率均隨pH的升高呈先升高后下降的變化趨勢;姜宏波等(2017)研究證實中華小長臂蝦在pH 6.0~9.0處理下的耗氧率和排氨率隨pH升高呈先下降后升高的變化趨勢。本研究結果表明,中華絨螯蟹幼蟹在pH 8.0處理下的耗氧率、排氨率和能量代謝率均最低,而在pH 6.0和pH 9.0處理下幼蟹的耗氧率、排氨率和能量代謝率明顯升高,即不適宜的pH能提高中華絨螯蟹的呼吸代謝。呼吸代謝提高可能是機體的保護性響應機制,有助于機體應對不利環境的刺激,與朱愛意等(2007)、章龍珍等(2009)的研究結果一致,即過高或過低pH均致使幼蟹發生應激反應,影響鰓組織進行離子交換,進而引起呼吸代謝異常。可見,pH 8.0更加適宜中華絨螯蟹幼蟹的生長,與劉金生等(2016)研究發現的中華絨螯蟹幼蟹最適生長pH相符。 甲殼類生物的代謝率受體質量影響顯著,代謝率與體質量間的關系可用R=aWb表示。式中,a為代謝水平,b為體質量指數(李俊輝等,2010)。a的大小受生物種類和環境因子的影響,b則與生物所處發育階段、攝食及溫度和鹽度等條件有關系(王崇懿等,2020)。本研究結果表明,在不同溫度和pH下,除10 ℃時的幼蟹排氨率隨體質量的增加而升高外,中華絨螯蟹幼蟹的耗氧率和排氨率均隨體質量的增加而降低。代謝率隨體質量的增加而降低,與皺肋文蛤(Meretrix lyrata)(栗志民等,2011)、彈涂魚(Boleophthalmus pectinirostris)(Cao and Wang, 2014)、虎斑烏賊(Sepia pharaonis)幼體(王鵬帥等,2017)及三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)(李朝華等,2017)等水產動物的研究結果相似。這可能與甲殼類生物在生長過程中各組織的比重有關,肝臟和腎臟等組織的代謝率高于肌肉、脂肪等其他組織(鄧超準等,2015)。幼蟹在生長過程中會累積肌肉和脂肪含量,導致肝臟等比值相對減少,從而導致耗氧率降低(李朝華等,2017)。 窒息點是水生生物對溶解氧需求和耐低氧能力的重要參數(李育森等,2019)。窒息點與物種、溫度、體質量、pH和氧張力等因素有關。通過對比相似條件下不同種類甲殼動物的窒息點(表4),結果發現中華絨螯蟹幼蟹的窒息點與其他甲殼類動物的窒息點范圍存在一定差異,說明不同物種具有不同的窒息點。大部分水產生物的窒息點隨環境溫度的升高而升高,如紅鰲鰲蝦(Chearx quadricarinatusvon Martens)(陳孝煊等,1996)、中華胭脂魚(Myxocyp‐rinus asiaticus)(金華等,2016)及羅氏沼蝦(陳琴等,2002a)等。但本研究并未發現溫度對中華絨螯蟹幼蟹的窒息點產生規律性影響,在25 ℃下其窒息點最低,表明中華絨螯蟹在適宜溫度下具有更好的低氧耐受性。 表4 不同種類甲殼類動物的窒息點比較Table 4 Asphyxiation point comparison of different crustaceans 體質量對窒息點的影響有2種類型:一類是窒息點隨體質量的增加而增加,呈正相關;另一類是窒息點隨著體質量的增加而減小,呈負相關(李朝華等,2017)。本研究中,中華絨螯蟹幼蟹在10~25 ℃下的窒息點均隨體質量的增加而減小,與陳琴等(2002c)在對合浦絨螯蟹豆蟹研究中得到的結果相似;而在30 ℃下幼蟹的窒息點隨體質量的增加而增大,與陳琴等(2002b)在對南美白對蝦仔蝦研究中得到的結果相似。水體pH過高或過低均會影響幼蟹攝取氧的能力,王輝等(2011)研究發現尼羅羅非魚幼魚在pH 8.06處理下的窒息點最低,增加或降低pH能有效提高幼魚的窒息點。同樣,本研究發現在pH 8.0處理下中華絨螯蟹幼蟹的窒息點最低,增加或降低pH均會提高幼蟹的窒息點。 溫度和pH變化對不同規格中華絨螯蟹幼蟹呼吸代謝指標均有顯著影響,其適宜生長溫度為20~25 ℃,適宜生長pH為8.0,過高或過低均會對中華絨螯蟹幼蟹機體造成應激反應,進而影響其正常生長及存活。

2.2 pH對中華絨螯蟹幼蟹耗氧率和排氨率的影響


2.3 溫度和pH對中華絨螯蟹幼蟹窒息點的影響

2.4 溫度和pH對中華絨螯蟹幼蟹氨商的影響

2.5 溫度和pH對中華絨螯蟹幼蟹能量代謝率的影響

3 討論
3.1 溫度對中華絨螯蟹幼蟹呼吸代謝的影響
3.2 pH對中華絨螯蟹幼蟹呼吸代謝的影響
3.3 體質量對中華絨螯蟹幼蟹呼吸代謝的影響
3.4 溫度、pH和體質量對中華絨螯蟹幼蟹窒息點的影響

4 結論