大動物AD模型研究進展

鐘偉聰，張然，皮榮標*

(1.中山大學醫學院，廣東 深圳 518107；2.中國農業大學生物學院，北京 100193)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是一種神經退行性疾病，影響著全世界2 500多萬人。同時，隨著老齡化的加劇，這個數字仍在不斷擴大，AD逐漸成為中國乃至全球最嚴重的社會危機。AD主要發生在老年人，特別是65歲及以上人群，是一種與年齡有關的中樞神經系統疾病。隨著年齡的增加，AD的患病風險成比例地增加。患有AD的患者通常呈現出神經精神癥狀(neuropsychiatric symptom,NPS)，表現為認知障礙、躁動、冷漠、焦慮等[1]。根據2020年世界阿爾茨海默病報告，三分之一的老年人死于AD或其他癡呆癥。對于患有AD的人來說，醫療保健和長期護理的費用相當大，造成了極大的經濟和社會損失。AD已經成為影響社會穩定發展和人類健康的嚴重問題[2]。AD的發病機制十分復雜，目前并沒有得到良好的闡明[3]，其主要特征是腦組織的淀粉樣多肽沉積Aβ和由Tau蛋白聚集形成的神經原纖維纏結(neurofibrillary tangles,NFTs)。因此目前主流的發病機制以Aβ級聯、異常Tau為中心。在藥物研發中，Aβ和Tau蛋白也是AD藥物設計的重要分子靶點。除此之外，線粒體功能紊亂、氧化應激、膽堿能和自由基損傷等也在AD的發展起著不可或缺的作用[4]。

在2021年6月，FDA批準Aβ抗體Aducanumab的上市，打破了近20年來沒有任何一款新藥在AD治療領域獲得批準的困局[5]。Aducanumab與我國自主研發的GV-971類似，在臨床研究中存在部分爭議，還需要進一步探究其治療機制和效果。最近，越來越多的研究表明神經退行性疾病和神經炎癥有密切的關系。小膠質細胞聚集在Aβ周圍，吞噬清除Aβ斑塊，提供保護作用[6]，但是過度激活的小膠質細胞分泌多種炎癥因子，并誘導產生神經元損傷，加劇Aβ和Tau病理變化等[7]。類似地，星形膠質細胞也被發現參與加速AD的病理進程[8]，這提示神經炎癥在AD中具有重要作用。開發多靶點的小分子藥物是目前的一個趨勢。血腦屏障對中樞神經系統內穩態進行調控，允許適當的神經元功能，也保護神經組織免受毒素和病原體的侵害，這些屏障對于機體來說具有重要作用[9]。小分子藥物相比于其他藥物，比如抗體類藥物，具有分子量小，容易穿過血腦屏障等優勢，更容易進入到大腦中。此外，許多小分子藥物原本并不是用于治療AD，而是抗癌藥、抗抑郁藥等，但在研究中發現，也能夠改善AD的癥狀，因而也被列入治療AD的范疇，這種方法可以極大降低治療費用[10-11]。

AD分為家族型AD(familial Alzheimer′s disease,FAD)和散發性AD(sporadic Alzheimer′s disease,SAD)，家族型AD是由與AD相關的基因突變導致，如APP、PS1、PS2基因；散發性AD則主要是由環境風險因素造成的，是后天產生的。在臨床前研究中通常采用的小鼠模型是家族型的小鼠模型，如轉基因小鼠等，但現實中遺傳型AD患者只占不到5%，大部分的AD患者是散發型的，因此轉基因小鼠模型不能代表普遍的AD患者。在AD領域也出現了一些與SAD有關的模型，這些模型主要是通過外源性的物質干擾小鼠體內代謝過程，最終引起相關病變，例如，腹腔注射脂多糖[12]；口服或腹腔給丙烯醛[13]；利用D-gal誘導的小鼠發生類似自然衰老的變化[14]；通過鏈脲佐菌素破壞葡萄糖運輸，導致AD樣病變[15]；除此之外還有利用東莨菪堿[16]、創傷性腦損傷[17]、疊氮化鈉[18]以及它們復合誘導[19]等方式構建散發性AD模型。然而目前關于AD相關研究的小鼠模型絕大多數都是用轉基因小鼠，如3×Tg、5×FAD等[20]。

小鼠和人類之間的許多解剖差異，在進行臨床應用時的轉換可能會出現困難[21]。除了常見的實驗室小鼠模型外，也有一些實驗室以豬、狗、兔子、貓和非人靈長類動物(non-human primates,NHP)等作為動物模型[22]，來進一步考慮疾病發病機制和藥物評估。相比小鼠，非嚙齒類動物在形態學和生存環境更接近人類，在疾病機理方面可能更為接近。豬、狗和NHP，它們腦部結構和功能特征與人類相似[23-25]，具備發展成為良好AD模型的潛力[26]，并且與兔子、貓型動物相比，它們的腦部結構更為大型，對實驗操作和實驗成本來說具有明顯的優勢。在本篇綜述中，簡要回顧了AD動物模型，特別聚焦于大動物模型，包括豬、狗、NHP的建立、病理特征(見表1)和潛在機制以及局限性(見表2)等，以期望后續能有突破性進展。

表1 模型的構建方法以及相關病理變化

表2 模型的優勢和不足

1 狗的AD模型

狗的基因組與人類有很強的相似性，狗腦的大小和復雜性與人腦也相似，是合適的大型神經動物模型[27]。狗是評估新型治療藥物的寶貴大型動物模型，現在許多藥物研究都已經在狗的身上開展[28]。狗與人類具有共同的生活環境，狗的某些疾病，與人類具有相同的機制，如癲癇，這提示狗的神經系統與人類具有高度的相似性[29]。類似人類AD，狗具有犬類認知障礙(canine cognitive dysfunction,CCD)，其發病機制尚不清晰，主要發生在8歲及以上的老齡狗，這些狗會出現步態紊亂、迷失方向、睡眠-覺醒周期紊亂、感知能力下降等癥狀[30]。通過從各地向狗主人招募實驗所用狗，并且利用犬認知功能障礙評定量表對實驗狗進行診斷。其中，總分低于39分的狗屬于正常認知狀態(非CCD)，總分為40～49分的狗屬于CCD風險，總分高于50分的狗屬于CCD。發現在不同品種的狗中都具有腦部出現Aβ積累這一重要特征[31-32]。這些Aβ的氨基酸序列與人類完全相同，常見的單體形式也是Aβ42。與CCD組(8～17歲)和年輕組(0～4歲)相比，4～8歲的狗的腦脊液中Aβ42濃度最高。此外，老年狗(8～17歲)的Aβ42濃度高于MCI組。進一步暗示狗的Aβ沉積與認知障礙具有正相關性。狗的Aβ似乎起始積累于前額葉皮質(發病時約8歲)，并隨著年齡的增長繼續發展，包括顳葉和枕葉皮質等其他區域。CCD與人類AD的早期階段非常相似，并且由于是自然發生的，更接近于散發性AD，因此CCD狗也被作為一種AD模型[33]。

免疫組化分析表明，根據評分表診斷為CCD狗的大腦額葉皮質各層一氧化氮合酶顯著增高，Prpar等[34]推測CCD狗中也存在嚴重的神經炎癥和亞硝化應激變化。但另有文獻表明，在CCD狗中，與神經炎癥有關的細胞因子，IL-2、IL-6、TNF-α等并沒有顯著性差異[33]，狗腦中的神經炎癥變化似乎不是很明顯，推測可能是實驗條件不同所引起的差異，還需要更多的研究才能確定CCD中的炎癥變化；一項核磁共振報道顯示CCD狗的海馬體積顯著減少，但與正常老年狗無明顯差異[35]；與此相反，Tapp等[36]發現狗的海馬萎縮越嚴重，認知缺陷越明顯。考慮可能是實驗動物數量限制以及實驗設備精準度的誤差引起的，提示不能完全將海馬作為觀測CCD狗的指標，應當結合其他病理特征綜合考慮；另有一項報道稱，通過免疫熒光證實p-Tau在狗的神經元軸突、體細胞積聚，并且還在少突膠質細胞內積聚，這與人類AD似乎有所不同，說明CCD狗的Tau病理與人類有所差異[37]。Opii等[38]發現，對8歲以上的比格老年犬進行抗氧化劑飲食干預和定期運動處理可以防止氧化損傷并有效干預CCD的發生。盡管Aβ和Tau病理都在CCD狗中發現，但是卻沒有發現由pTau聚集形成的NFTs[39]。對此有人提出了纏結前的病理學，并解釋患有CCD的狗沒有NFT的可能原因[40]：①人在患有AD前，大腦中的Aβ就開始了聚集現象，而Tau的聚集與認知障礙更為緊密。狗的壽命相對較短，而AD隨著時間愈發嚴重，因此時間不足以使Tau聚集形成NFTs。同時這個解釋合理之處還在于，目前有研究認為認知障礙主要歸結于Tau，而狗中沒有足夠的NFTs，因而狗的認知障礙不是十分明顯；②狗的Aβ基因與人類完全相同，但Tau蛋白基因略有差異，因此可能影響Tau蛋白的聚集。目前，以狗作為研究模型的一個主要的缺點是培養成本較高，所需要的實驗周期也較長，并且大多數研究都是通過募集獲得，缺少系統性。同時，實驗數據通常是在已發生病理改變后測得的，一些病理改變難以被測量，缺乏從正常到病發的漸進變化過程。盡管如此，Aβ、Tau病理、神經元丟失、認知障礙等都在CCD狗中發現；同時，藥物在狗身上也表現出類似人的藥代動力學；另外，和人類似，狗具有一定的社會性。因此將狗作為臨床前模型來進行預防研究可能是有效的。

2 豬的AD模型

與狗模型可作為同伴相比，可食用的豬在研究模型上受到社會的關注度較低。人類和豬的基因組相似，特別是APP基因[41]，同時發育和組織結構也同人類高度相似。另外，豬腦在腦損傷后，Aβ也會發生積累現象[42]，提示豬作為神經退行性疾病，特別是AD模型的可行性。實際上，將豬作為疾病模型已經得到很多應用，包括心血管疾病、癌癥、腦疾病等。在某種程度上，豬是轉化醫學的首選物種[43-45]。

創傷性腦損傷是人類AD的一個易感因素，Smith等[46]通過頭部旋轉處理小型豬，模擬腦損傷。漢福德系(Hanford)小型豬在造模后1 d，軸突就發生腫脹；造模后3 d，Aβ和Tau在受損軸突中的積累，Aβ斑塊沉積于白質中。目前將豬作為模型進行AD研究的僅少數幾家實驗室，并且是以轉基因的方式進行模型構建。研究者將與AD有關的基因導入豬中，以期望能構建出一種優良的臨床前轉基因豬模型來研究AD。Kragh等[47]首次將由sPDGFβ啟動子驅動的APP695sw基因導入哥廷根系(G?ttingen)小型豬的基因組中。3個月處死后，發現引起了該基因水平的上升，內源性APP695蛋白水平是對照組的10倍以上，但并沒有導致Aβ水平的變化。與人和小鼠類比，作者推測需要達到30個月后，豬才會出現Aβ的積累。與Kragh同一個實驗室的Jakobsen則嘗試將PSEN1M146I基因插入到G?ttingen小型豬的基因組中，但只驗證了其插入的成功性，并未對AD的癥狀進行相關驗證[48]。另有研究報道了在雌性G?ttingen小型豬中轉入APPSW單基因，2年后檢測，并沒有觀察到AD的病理蛋白，包括Aβ和Tau的積累。同時也沒有造成模型豬的記憶損傷[49]。2016年，Jakobsen等[50]培育了雙轉基因G?ttingen小型豬，該小型豬同時攜帶人類PSEN和APPSW基因。在雙轉基因的參與下，豬在10至18個月大時，神經內的Aβ斑塊形成增加，但并沒有與時間成正相關。至此，以豬作為模型研究AD獲得了開創性的新進展。2017年，Lee等[51]開發了含有hAPP、hTau和hPS1三轉基因的黑豬(Jeju black pig)，并獲得不錯的結果。造模后70 d，在轉基因豬腦中發現了高表達的Aβ和Tau，同時還注意到了神經炎癥癥狀。與此同時，Wang等[52]用CRISPR/Cas9系統生成DJ-1/parkin/PINK1三基因修飾的巴馬小型豬，但是在10個月大的活突變豬中并未觀察到帕金森病的典型癥狀。盡管如此，CRISPR/Cas9技術的成功應用，也為其他疾病模型提供新的思考方向。豬作為疾病模型，具有前景性，但仍有一些局限性需要解決。比如需要大面積的空間進行飼養，需要更多的飼養資源，需要專門的動物知識來確保適當的健康生活方式，并且目前并沒有一種良好的行為學的檢測手段等[53]。豬的神經退行性疾病的建模目前尚處于起步階段，因此對當前模型的深入描述和長期跟蹤非常重要，為以后的動物實驗模型提供了寶貴經驗。同時為類似于ALS等其他神經退行疾病的研究創造一個前所未有的良機。

3 NHP AD模型

NHP與人類高度相似，包括基因組、形態結構、以及發育等，對某些疾病也具有相似的易感性。結構與功能的相似性使其成為研究人類的良好工具[54]。NHP已經被開發出了許多疾病模型，包括代謝、血管和神經退行性疾病等。NHP與人類最長形式的Tau蛋白的基因序列的相似性大于98%，而與Aβ序列完全一致，提示NHP可能是研究AD的重要模型[55]。前期研究表明在獼猴、黑猩猩、狨猴等NHP中存在AD的一些病理特征，包括Aβ沉積、代謝紊亂等[56-60]。NHP的Aβ發展與人類高度相似，并且與人類一樣，隨著年齡的增加而逐漸積累，最終導致認知功能發生障礙，提示將NHP發展為AD疾病模型的合理性。盡管多篇文獻都表明NHP不會出現AD另一個顯著特征——NFTs，但是也有報道指出NHP中存在Tau的磷酸化現象[61]，表明NHP也可能具備Tau病理學。將NHP作為AD疾病模型已經得到鑒定，并且在近幾年得到了廣泛的關注[62]，特別是在散發性AD的研究中。早期的研究表明灰鼠狐猴在幼年時就形成了Aβ斑塊，表現出一些Tau病理學的跡象，并出現與年齡相關的認知缺陷[63]。近年來，其他品種的NHP也得到許多關注。

據報道，老年的，特別是大于15歲非洲綠猴，可能會呈現出一系列的AD癥狀。它們在衰老過程中容易患上與人類相似的疾病，因此越來越多地被用作模型。研究發現，19歲以上的雌性非洲綠猴在顳葉中出現以彌漫性斑塊為主的Aβ沉積，這些Aβ是由被認為是最具毒性的單體Aβ42所構成的；在皮質中可以檢測出高磷酸的Tau，并且存在成對螺旋樣結構(paired helical filaments,PHF)，但鮮有NFTs；同時，星形膠質細胞的增生也提示了神經炎癥的發生；通過MRI測量顳葉以及海馬，發現發生萎縮現象，這也與老年非洲綠猴的認知障礙的發生有關[64-65]。同時，Cramer等[66]在雄性非洲綠猴中也發現類似病理性現象，并比較了非洲綠猴與人類轉錄組變化，衰老的非洲綠猴能夠很好的模擬人類的轉錄變化。恒河猴是NHP的另一個主要品種，老年恒河猴在大腦中自然形成Aβ沉積，與老年人的大腦具有驚人的相似性。研究表明，19歲以上的正常老年恒河猴，腦組織會出現Aβ反應性老年斑，并且這些老年斑具有多種聚集形式，包括三聚體、五聚體等，但缺乏毒性Aβ二聚體、p-Tau、膠質增生和突觸損傷等[67]。另一文獻證實，老年恒河猴表現出與人類類似的Aβ皮質病理。但是提出了恒河猴具有Tau病理的觀點。他們發現Tau蛋白在恒河猴7～9歲時有磷酸化現象(pSer214tau)，并在31歲的恒河猴中發現了典型的NFT和PHF結構，證實了Tau病理的存在[68]。Tau檢測的差異也被提及，他們在灌注的恒河猴大腦中檢測到早期種類的磷酸化Tau，但在死后丟失，作者推測這種丟失可能是闡明發病機制的關鍵。Edler等[69]在37歲以上的黑猩猩中大腦發現Aβ42斑塊分布在皮層區；在CA1和CA3的錐體層中發現了Tau病理標記物和神經絲。除此之外，在血管中也檢測到Aβ陽性等。同時，該小組還表明老年黑猩猩在各腦區，特別是皮質海馬區存在活化的小膠質細胞，與較高水平的Aβ42斑塊有關[70]。

自然老化的NHP在病理發生上與人類相似，對于研究AD風險因素具有優勢，但是實驗周期太長，少則10年，多則30年，而且老年的NHP不一定都患上AD樣癥狀，因此對于實驗室團隊來說十分不利。研究者開始在NHP中通過人工的方法快速構建出一種AD樣的模型。據報道，目前在NHP中構建的方法包括注射膽堿能神經毒性藥物、注射可溶性Aβ、注射或口服甲醇，以及通過轉基因的方法等[71-74]。NHP是理想神經疾病的模型，但目前仍有許多問題需要解決，比如相較于藥物毒理學和藥理學方面較為成熟的小鼠模型來說，藥物的劑量更加嚴格。其次所有的NHP都是瀕危物種，出于倫理的要求，可用的動物量也十分有限[71]。同時NHP的培養成本極高，包括飼料、住宿條件以及實驗周期等。雖然在NHP中取得一定的進展，但對于NHP的研究還是道阻且長。

4 結語與展望

AD是一種復雜的多因素誘導的疾病，目前對于其產生機制尚不清晰，對機制和治療藥物的探索十分緊迫。盡管在研究小鼠中得到較好的結果，闡明了部分AD病理過程，以及一些相關機制，包括Aβ和Tau病理等。但在進行臨床轉化時，效果往往不佳?，F有的小鼠動物模型不能完全準確地反映人類AD[75]。豬、狗、NHP、兔子、貓等動物模型相較于小鼠來說，它們的病理分子序列更加同源，并且生存的環境與人類也十分相似，甚至飲食和易感性也高度相同。此外，豬、狗、NHP在體型上比兔子、貓、小鼠更大，在實驗中更容易操作，能夠減少和節約實驗時間和實驗成本等。豬、狗、NHP有類似人類的結構和功能特征，特別是腦部結構。這些大動物是研究衰老大腦中發生的分子和行為改變的重要模型。腦部結構的相似性也為藥物的研發提供一定的借鑒性，可以作為嚙齒動物和人類研究之間的中介，有利于我們更好的理解AD的發病機制。

NHP是目前模擬人類的最佳模型，但是其作為瀕危物種，在實驗上具有相當的限制性。最近，有研究者通過體細胞核移植技術在體外成功克隆了食蟹猴[76]，這種克隆技術使得研究人員能夠更好地利用靈長類動物進行實驗研究。在未來，或許能夠通過該技術打破在研究數量的局限性，并發展成對人類疾病機制和治療研究中重要的動物模型。豬模型和狗模型在模擬疾病方面也具有一定的優勢。或許進一步打破豬模型和狗模型在實驗周期、檢測手段的限制后能夠有效地解放以NHP作為實驗動物的現狀，減少瀕危物種的使用，同時也為其他疾病模型帶來一些新啟發。一項基因修飾豬的腎被移植到了人的事件廣受傳播。這是世界首例的，異種移植后的豬腎可以正常工作，并且有趣的是，移植后的豬腎并沒有產生免疫排斥現象[77]，這項巨大的突破也提示了豬和人器官的同質性，鼓舞了以豬作為研究對象所開展的研究。最近，有研究者開始著手構建人工智能(artificial intelligence,AI)驅動的數字動物仿真技術，力圖通過AI技術模擬評估藥物在動物體內的藥效學、藥代動力學和相關毒性等。利用這種模擬評估，可以有效地減少對于動物的傷害，減少實驗相關成本和時間，減少對社會的負擔，提高效率等，可能是目前較為先進和符合倫理的方法。但是其實際效果難以衡量，還是需要結合傳統實驗進行相關驗證，進一步確認有效性。

藥物研發離不開動物模型，動物模型驗證藥物的合理性。小分子容易穿透血腦屏障，小分子的再利用能夠有效地減少研發時間以及成本，在近幾年進展迅速。神經系統是個復雜的網絡，在靶向AD之外的神經退行性疾病，如PD、抑郁癥、自閉癥的藥物中，可能存在某些在AD中也有療效的藥物，而這些藥物有些已通過相關臨床實驗，能夠減少藥物進入AD臨床實驗的時間。研究表明抗抑郁藥西酞普蘭，一種選擇性的5-羥色胺再攝取抑制劑，能夠在小鼠體內有效地抑制Aβ沉積[78]，并且進入AD的臨床實驗中。同時，小分子具有優良的可塑性。有研究者試圖將有功能性的官能團組合成一個小分子，形成了具有多靶點抗AD的藥物，并通過體內和體外實驗表明多靶點藥物在AD的治療中具有重要的作用[79]，因此在藥物的多功能性方面，還需要進行更多的研究。此外，通過計算機輔助運算，能夠加快藥物的篩選。最近有文獻通過計算機模擬以及小鼠模型驗證的方法，表明抗心力衰竭疾病的Bumetanide可能能夠預防AD[80]。將AI應用到藥物評估中，通過AI技術篩選出適合藥物，動物仿真技術模擬評估，與傳統的實驗技術相結合加以驗證，能夠更快、更經濟和有效地尋找新藥[81]。不僅能提高效率，也減少盲目篩選藥物的成本，提高費效比，更加符合現代倫理要求等。另外。存在一些藥物在小鼠體內毒性明顯，而在人體時毒性較低。在目前的以小鼠為主的研究中，這些藥物將不被納入考慮中，因此可能存在藥物篩選不當。AI藥物評估和豐富的動物模型可以有效減少這些漏洞，增加藥物的研發可能。此外，在進入臨床實驗前，多樣的動物模型所研究的毒性也有助于在臨床試驗的劑量評估。

綜上所述，現存的AD疾病模型并不能很好的全面闡述AD的發病機制，也不能完全模擬出AD的所有癥狀，在藥理評估方面還不夠完全。本文回顧和總結了幾種大動物模型的病理學特點。與人類基因序列高度同源的大動物顯示出了其發展為AD模型的潛力。相較于小鼠模型，相似的結構以及疾病易感性的大動物可能更適合評估候選藥物的抗AD作用。