轉運體生物標志物的研究進展

王嘉馨，林以寧

(中國藥科大學中藥學院，江蘇 南京 211198)

藥物轉運體可以通過調節底物藥物的吸收、分布、代謝、排泄過程來決定其在體循環和組織中的暴露程度[1]。隨著對轉運體研究的不斷深入，其底物除藥物外還包括各種內源性代謝物、微生物群和食物中含有的天然化合物。其中部分內源性物質作為轉運體的底物，其濃度會隨著轉運體表達變化而變化[2]。因此，這些內源性物質將有潛力作為生物標志物來研究人體內轉運蛋白的功能。

1 轉運體的分布及功能

轉運體作為一類功能性膜蛋白分布于體內各臟器組織，介導著內源性化合物與外源性物質的跨膜轉運過程。根據其底物的跨膜轉運方向可將轉運體分為攝取型轉運體(uptake transporters)和外排型轉運體(efflux transporters)。其中攝取型轉運體亦屬于可溶性載體 (solute carrier,SLC)，主要包括有機陰離子 (organic anion transporters,OATs) 及陽離子轉運體 (organic cation transporters,OCTs)、鈉依賴性葡萄糖轉運體 (sodium dependent glucose transporters,SGLTs)、氨基酸轉運體 (L-type amino transporter,LAT)等。外排型轉運體屬于ATP結合轉運體 (ATP binding cassette,ABC)，包括多藥耐藥相關轉運體 (multidrug resistance associated proteins,MRPs)、 乳腺癌耐藥轉運體(breast cancer resistance protein,BCRP)、P 糖蛋白 (P-glycoprotein,P-gp)等。

1.1 有機陰離子轉運多肽(OATPs) SLC21/SLCO家族成員，有機陰離子轉運多肽1B1(organic anion-transporting polypeptide 1B1，OATP1B1)、有機陰離子轉運多肽1B3(organic anion-transporting polypeptide 1B3，OATP1B3)主要在人體肝臟中表達，介導內源性物質和外源性物質通過肝細胞基底外側膜從門靜脈血液進入肝細胞。OATP1B1和OATP1B3底物有部分重合，但對各自底物的親和力有所不同。通過OATP1B1和OATP1B3轉運的內源性物質主要有膽汁酸、糞卟啉和膽紅素等。OATP1B1和OATP1B3底物藥物包括他汀類如瑞舒伐他汀，抗癌藥物如甲氨蝶呤，以及利福平等抗生素[3]。

1.2 有機陰離子轉運體(OATs) 有機陰離子轉運體中的OAT1和OAT3主要在人體腎臟中表達，定位于近端小管細胞基底膜。內源性物質如α-酮戊二酸酯和前列腺素E2等屬于OAT1和OAT3的底物[4]。部分藥物阿昔洛韋、甲氨蝶呤、環丙沙星等屬于OAT1的底物，OAT3底物藥物主要為呋塞米、布美它尼及幾種非甾體消炎藥等。丙磺舒與新生霉素是OAT1與OAT3的主要體外抑制劑[5]。

1.3 有機陰陽離子轉運體(OCTs) 有機陽離子轉運體2(OCT2)與OAT屬同一家族，主要表達于人體腎臟，定位于近端小管細胞基底外側膜。OCT2以非鈉依賴的方式轉運帶正電荷的化合物，在腎臟分泌有機陽離子的過程中發揮重要作用，其體外底物有1-甲基-4-苯基吡啶陽離子(MPP+)、四乙基銨(TEA)等。其內源性底物包括乙酰膽堿、肌酐、N1-甲基煙酰胺和腎上腺素等。

1.4 多藥及毒性化合物外排轉運蛋白(MATEs) 多藥及毒性化合物外排轉運蛋白1(multidrug and toxin extrusion proteins 1,MATE1)和MATE2-K屬于溶質載體家族SLC47。MATE1在腎臟、肝臟、腎上腺以及其他組織中表達，而MATE2-K主要在腎臟中表達。MATE1和MATE2-K都位于腎近端小管的刷狀邊緣膜，介導有機陽離子向細胞外轉運[6]。MATEs與OCT2的底物有部分重疊，在腎小管分泌中共同發揮作用。MATEs的內源性底物有N1-甲基煙酰胺、肌酐和硫胺素等，二甲雙胍、普魯卡因等屬于其外源性藥物底物。

2 生物標志物的要素

一系列藥物轉運體以結構多樣的臨床藥物為底物，通過促進這些藥物從血液循環中被攝取或隨后外排到另一側來調節藥物的藥代動力學。此外，藥物轉運體的功能可以被更廣泛的抑制劑抑制。因此，在藥物開發過程中，識別每個藥物轉運體的底物和抑制劑對于研究藥物相互作用(drug-drug interaction,DDI)中底物藥物的臨床藥代動力學特性有重要意義[7]。由此，多種轉運體底物藥物組成的“雞尾酒”探針常被用來研究DDI，以期減少分析底物藥物所需臨床研究的數量。然而，在臨床數據有限的情況下，通過分析內源性生物標志物來探究DDI不失為一種可行的替代方法[8]。評估一種內源性化合物能否作為研究轉運體功能的生物標志物，需要從多個方面進行驗證[8]。

2.1 靈敏度 生物標志物的濃度變化程度應能區分弱、中、強的抑制劑，并能預測臨床相關藥物引起的DDI。此外，生物標志物應能在合適的基質(血漿、血清、尿液、唾液等)中被檢測到，且具有穩定的基線、較小的個體間變異性[2]。

2.2 選擇性 由于許多藥物轉運體的底物相互重疊，尋找對某一轉運體具有高度特異性的生物標志物并不現實，因此，半選擇性生物標志物的研究可行性更高。另外，將生物標志物的體內測定數據與單一轉運體的體外數據相結合，能更好地綜合評估其選擇性并建立體內外相關性。

2.3 穩定性 在理想情況下，生物標志物的水平不應受到疾病狀態、日變化、年齡、飲食或鍛煉等因素的影響。此外，應考慮生物標志物的生成和降解速率，以便在臨床環境中進行監測[9]。還應探索評估生物標志物形成和消除速率的建模方法，用于判斷生物標志物是否適合于臨床應用，并指導生物標志物樣本采集的時間和頻率。

2.4 其他要素 理想的生物標志物應具有明確的最佳動力學參數，例如血漿濃度、藥-時曲線下面積(area under concentration-time curve，AUC)或腎臟清除率(renal clearance，CLr)等。此外，還應具備可預測性，即轉運體抑制劑引起的內源性生物標志物的變化最好能夠與DDI中轉運體抑制劑引起其他合用藥物藥動學的變化建立定量關系。

3 肝腎轉運體潛在生物標志物

生物標志物作為一種評價生理過程、病理過程和藥物干預反應的指示物，常被用于評估DDI中轉運體的抑制作用。一些內源性化合物已被鑒定為部分肝腎轉運體的潛在生物標志物，在評估轉運體功能方面具有重要作用。

3.1 OATPs的生物標志物

3.1.1 糞卟啉Ⅰ和Ⅲ(coproporphyrins Ⅰ and Ⅲ) 糞卟啉Ⅰ和Ⅲ都是OATP1B1和 OATP1B3的底物[10]。糞卟啉Ⅰ是血紅蛋白生物合成過程中的代謝產物，由于其日變化及個體間變異性微小，且在給予OATP1B抑制劑后濃度變化迅速而顯著，是OATP1B生物標志物的不二之選[11]。有研究表明，在給予OATP抑制劑利福平后，糞卟啉Ⅰ和Ⅲ的最大血藥濃度(Cmax)增加5倍， AUC增加3倍，且尿中糞卟啉Ⅰ含量增加約3.5倍，說明血漿糞卟啉Ⅰ和Ⅲ以及尿糞卟啉Ⅰ都是研究OATP參與DDI的較為合適的生物標志物[12]。

糞卟啉Ⅰ和Ⅲ是一對同分異構體，但糞卟啉Ⅰ比糞卟啉Ⅲ更適合做OATP1B的生物標志物，原因如下：①糞卟啉Ⅲ還能被OATP2B1轉運，而糞卟啉Ⅰ不能；②糞卟啉Ⅲ的血藥濃度比糞卟啉Ⅰ低5.7倍，需要高靈敏度的分析系統進行定量；③人類糞卟啉Ⅲ的腎清除率是糞卟啉Ⅰ的6.2倍[12]；④利福平誘導糞卟啉Ⅲ的AUC變化小于糞卟啉Ⅰ,表明OATP1B對糞卟啉Ⅲ系統性消除效果較弱。

3.1.2 膽紅素 OATP1B1和OATP1B3能夠轉運膽紅素和結合膽紅素，并且在其處置過程中發揮重要作用[13]。除OATPs外，結合膽紅素還通過定位于肝細胞小管膜的共軛外排泵多藥耐藥蛋白2(multidrug resistance associated protein 2,MRP2)以及定位于肝細胞竇膜的MRP3進行轉運[13]。有體外研究和大鼠實驗表明，結合膽紅素可作為臨床早期藥物開發中探究OATP/MRP2抑制的生物標志物[14]。有研究發現，OATP抑制劑利福平可使總膽紅素的AUC和Cmax分別增加2.1和2.3倍[15]。有學者認為膽紅素血漿濃度的變化相對較小，在評估較弱的OATP抑制劑時尤為明顯，說明膽紅素作為內源性生物標志物的靈敏度有限[15]。此外，多種酶和轉運體都參與了膽紅素的處置，如果將膽紅素用于研究OATP參與的DDI，應全面評估藥物的特異性[15]。

3.1.3 甘氨鵝脫氧膽酸硫酸鹽(glycochenodeoxycholate sulfate，GCDCA-S) GCDCA-S能被OATP1B1和OATP1B3轉運[16]，是膽汁酸的主要硫酸化產物，在血清和尿液中約占總膽汁酸硫酸化產物的四分之一。膽汁酸的合成是多種酶參與的多步驟過程，而磺基轉移酶2A1催化的膽汁酸硫酸化是膽汁酸進一步代謝的主要途徑。膽汁酸硫酸化后，膽汁酸鹽的溶解度提高、腸肝循環減弱、排泄增加，可促進膽汁酸解毒和排泄。在健康志愿者中，GCDCA-S的血漿濃度呈現晝夜變化趨勢[17]。一般情況下，進食后血清膽汁酸濃度升高，而尿液膽汁酸濃度略有下降[18]。性別、年齡、體重指數和適度飲酒對血清和尿液的膽汁酸濃度影響很小[18]。雞尾酒試驗表明，與配方中3種探針藥物相比，利福平對GCDCA-S的AUC影響更明顯，由此，GCDCA-S有可能作為內源性生物標志物來研究體內OATP的活性[16]。

3.1.4 膽汁酸和膽汁酸結合物 有學者研究了OATP1B1和OATP1B3介導的5種人體主要膽汁酸及其甘氨酸和?；撬峤Y合物的轉運，包括膽酸(CA)、鵝去氧膽酸(CDCA)、去氧膽酸(DCA)、熊去氧膽酸(UDCA)和石膽酸(LCA)。結果表明CA、CDCA、DCA以及甘氨酸和?；撬峤Y合膽汁酸能被OATP1B1和OATP1B3轉運，且與膽汁酸相比，膽汁酸結合物與OATP1B1和OATP1B3的親和力更強[19]。膽汁酸自身的腸肝循環是影響其血漿濃度的重要因素，除體循環的清除機制外，在腸肝循環過程中可能存在與藥物相互作用的位點，導致其血漿濃度-時間分布的改變[7]。

有研究者考察了13種膽汁酸作為OATP活性的內源性生物標志物的適用性，發現其中8種膽汁酸的血漿濃度在第一次進食后顯著增加。給予OATP抑制劑利福平后部分膽汁酸如甘氨脫氧膽酸等的血漿濃度均顯著升高，但重復模型顯示其血漿濃度的增加并不顯著[20]。具體哪些膽汁酸或膽汁酸結合物適合作為OATP1B的內源性生物標志物，還有待進一步的研究。

3.2 OATs的生物標志物

3.2.1 6β-羥基氫化可的松(6β-hydroxycortisol，6β-OHF) 6β-OHF是評價OAT3活性的一種重要內源性生物標志物，由肝臟CYP3A4酶代謝生成并經尿液排泄，其血漿濃度具有明顯的晝夜節律[21]。體外研究表明，6β-OHF是OAT3、MATE1和MATE2-K的底物[22]。有學者評估了OAT抑制劑丙磺舒和MATE抑制劑乙胺嘧啶對6β-OHF腎臟清除率的影響，結果表明與對照組相比，丙磺舒給藥組6β-OHF的AUC顯著升高，且6β-OHF的CLr顯著降低。雖然給予乙胺嘧啶后6β-OHF的AUC有所增高，CLr也有所降低，但變化并沒有統計學意義，說明6β-OHF對MATE的特異性低于OAT[21]。體內和體外數據均證實了OAT3在6β-OHF的腎臟分泌過程中發揮重要作用，說明6β-OHF可能是評估OAT3功能的潛在內源性生物標志物。

3.2.2 ?；撬崤c甘氨鵝脫氧膽酸硫酸鹽(GCDCA-S) ?；撬岷虶CDCA-S分別為OAT1和OAT3的內源性底物。?；撬崾且环N可從食物中獲得也可通過人體自身合成的氨基酸。有學者研究了丙磺舒對血漿和尿液樣本中內源性化合物濃度變化的影響，認為牛磺酸和GCDCA-S可作為評估OAT功能的內源性生物標志物[17]。與6β-OHF相比，丙磺舒對?；撬岷虶CDCA-S的AUC無影響，但在口服丙磺舒后，?；撬岷虶CDCA-S的CLr均顯著降低[17]。此外，有研究表明丙磺舒可通過抑制參與GCDCA-S重吸收的OAT4和參與GCDCA-S尿排泄的MRP2影響GCDCA-S的CLr，由此，GCDCA-S是否適合作為OAT內源性生物標志物還需要進一步綜合評估[23]。總體數據表明，?；撬岷虶CDCA-S可作為評估OAT1和OAT3功能的潛在生物標志物。

3.3 OCT、MATE的生物標志物

3.3.1 硫胺素 硫胺素也被稱為維生素B1，被硫胺素焦磷酸激酶轉化為硫胺素焦磷酸，可作為輔酶參與細胞代謝的關鍵反應。有研究者通過代謝組學分析，證明了硫胺素是人類OCT1的底物。然而，硫胺素對OCT1的選擇性很低，因為它也是OCT2、MATE1、MATE2-K以及硫胺素轉運體1和2(THTR1和THTR2)的底物[24]。THTR1和THTR2在各種組織中廣泛表達且在硫胺素的重吸收和排泄過程中發揮重要作用，因此，想要通過硫胺素血漿濃度變化來指示OCT1功能，需要進行更加全面的分析[25]。

有研究證明硫胺素可用于監測MATE的抑制作用[24]。該研究分析了乙胺嘧啶對二甲雙胍藥代動力學的影響，并對血漿和尿液樣本中的硫胺素進行分析，結果表明硫胺素的血漿濃度幾乎未受到影響，但其CLr降低了70%～84%。而在給予乙胺嘧啶后，低劑量和治療劑量的二甲雙胍CLr僅分別降低了23%和34%[24]。這一結果說明，與二甲雙胍相比，硫胺素通過CLr評估乙胺嘧啶引起的MATE抑制時可能具有更高的靈敏度。硫胺素有作為OCT和MATE內源性生物標志物的潛力，但其他OCT/MATE抑制劑對硫胺素的血漿濃度及CLr的影響還有待進一步研究[26]。

3.3.2 N-甲基煙酰胺 N-甲基煙酰胺是色氨酸和煙酸的代謝產物。N-甲基煙酰胺是OCT2、MATE1和MATE2-K的底物，體外研究證實乙胺嘧啶能夠抑制這些轉運體對N-甲基煙酰胺的攝取。在健康受試者中，N-甲基煙酰胺的血漿濃度遵循晝夜節律。有報道稱，低溫引起的物理應激會增加尿中N-甲基煙酰胺的排泄；在妊娠中后期，N-甲基煙酰胺的CLr有所增加[27]；某些疾病也可以影響N-甲基煙酰胺的藥代動力學。有研究表明，給予MATE抑制劑乙胺嘧啶后，N-甲基煙酰胺的尿排泄量和CLr都有所降低[28]。N-甲基煙酰胺是用于研究OCT/MATE參與的DDIs的潛在生物標志物，與此同時，N-甲基煙酰胺的CLr變化的靈敏度、N-甲基煙酰胺對其他MATE1及MATE2-K抑制劑的特異性等還需要進一步研究[29]。

4 生物標志物評估轉運體功能的意義及局限性

目前，使用體外數據來評估藥物轉運體DDI仍存在一些局限性。例如，一些轉運體含有多種藥物結合位點，導致其抑制作用呈底物依賴性，從而使得體外模型的研究數據在推測臨床DDI時更加困難。且候選藥物在體外的低溶解度以及非特異性結合現象往往使數據分析過程復雜化。因此，僅靠體外研究數據推測臨床藥物轉運體的DDI是不現實的，需要對作為研究轉運體DDI潛在指標的內源性生物標志物進行分析，以補充和完善藥物轉運體的體外數據[8]。

大多數生物標志物的靈敏度低于藥物特異性探針，其背后的原因值得進一步探究。內源性生物標志物與藥物探針的主要區別之一，是內源性生物標志物是體內形成的化合物，而藥物探針的暴露受其吸收和分布的影響。除非生物標志物在穩態條件下其血漿濃度較為穩定，否則DDI對其體內暴露的影響除了取決于轉運體介導的消除速率外，還取決于其生成速率。因此，直接比較二者AUC變化可能會低估內源性生物標志物的靈敏度[8]。此外，在解釋生物標志物水平為何變化時，應從多個方面考慮其原因。例如，血漿中膽紅素或結合膽紅素的濃度升高，可能是由于OATP1B、MRP2的抑制，也可能是肝損傷所致[13]。

將內源性生物標志物用于指示轉運體功能的主要困難之一，是對其形成、處置和消除機制的了解還不夠全面。再者，生物標志物的選擇性、特異性、靈敏度以及受試者間的可變性等需要進行綜合評估[30]。一些潛在的生物標志物，如膽汁酸或膽紅素，其水平變化與器官損傷或疾病發展有關，導致其評估轉運體DDI更加困難。此外，部分生物標志物的來源還包括膳食成分或代謝物，在進行分析時應注意排除食物的影響。

5 展望

近年來，用內源性化合物評估轉運體介導的DDI受到了越來越多的關注，這些研究成果將有助于藥物開發和臨床階段轉運體變化的機制研究，從而達到提高藥物開發及治療安全性的目的。然而，目前對于影響生物標志物體內處置因素的探究以及用于評估生物標志物的模型研究還有待完善。還有許多轉運體的內源性功能并不明確，例如P-糖蛋白(P-gp)和乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)，關于其內源性底物的研究十分有限，其內源性生物標物的驗證也許是今后研究的一個方向。