基于基因芯片對(duì)癲癇小鼠海馬組織miRNA-204表達(dá)的研究及生物信息學(xué)分析

吳 瓊， 呂婷婷， 刁麗梅

癲癇(Epilepsy)是由于大腦神經(jīng)元異常放電引起短暫大腦功能失調(diào)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，對(duì)患者學(xué)習(xí)和生活產(chǎn)生嚴(yán)重影響。全球每年有240萬(wàn)人被診斷為癲癇，近30%的患者抗癲癇藥物無(wú)法控制癲癇發(fā)作，急需新的治療方法[1]。MicroRNA(miRNA)是一種長(zhǎng)度為20～24個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼蛋白的RNA，其通過(guò)與靶基因特定序列相互作用，調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)的活性。miRNA異常的調(diào)節(jié)對(duì)癲癇的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生重要的影響，可能成為癲癇的潛在生物標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)。本研究利用基因芯片技術(shù)挖掘差異基因，并對(duì)差異基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，探索miRNA對(duì)癲癇治療靶點(diǎn)作用機(jī)制，開(kāi)拓癲癇診斷與治療新的思路。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性昆明小鼠20只，清潔級(jí)，約25～30 g。昆明小鼠由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購(gòu)買。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 鹽酸匹羅卡品(美國(guó)Sigma公司)、氯化鋰(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海試劑公司)、硫酸阿托品注射液(鄭州鈴銳制藥有限公司)、Aglient 2100 Bioanalyzer(美國(guó)Agilent公司)、Thremo Nanodrop 2000(美國(guó) Thremo公司)、GeneChip Scanner 3000(美國(guó)Affymetrix公司)、GeneChip Fluidics Station 450(美國(guó)Affymetrix公司)、GeneChip Hybridization Oven 645(美國(guó)Affymetrix公司)。

1.2 方 法

1.2.1 模型制備 將制昆明小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為造模組和對(duì)照組。造模組：昆明小鼠腹腔注射氯化鋰(127 mg/kg)，18～24 h后注射阿托品 (1 mg/kg)，30 min后腹腔注射匹羅卡品(10 mg/kg)，每2 d進(jìn)行造模實(shí)驗(yàn)1次，共5次，Ⅳ級(jí)以上發(fā)作為造模成功。對(duì)照組：同樣方法注射生理鹽水。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程 分別取造模組和對(duì)照組小鼠腦部海馬組織，進(jìn)行基因芯片檢測(cè)，選出模型組和對(duì)照組表達(dá)差異的基因。采用miRNA靶基因預(yù)測(cè)工具TargetScan、rna22、miRBase進(jìn)行預(yù)測(cè)并取交集。利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，將取交集后靶基因基因按功能分為3大類：生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能3類，后進(jìn)行KEGG通路分析。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù) 使用SPSS 21.0進(jìn)行處理，組間比較使用t檢驗(yàn),P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 差異基因 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，篩選|FC|≥ 1.5的miRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)分析：相對(duì)表達(dá)增多的差異miRNA 10個(gè)，相對(duì)表達(dá)減少差異miRNA 18個(gè)，結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)，選取 miRNA-204進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

2.2 靶基因預(yù)測(cè) 采用TargetScan共預(yù)測(cè)到miRNA-204靶基因6762個(gè)，rna22共預(yù)測(cè)到miRNA-204靶基因14335個(gè)，miRBase共預(yù)測(cè)到miRNA-204靶基因587個(gè)，取三者交集得到457個(gè)共同的靶基因。

2.3 靶基因GO分析 通過(guò)DAVID分析工具對(duì)miRNA-204靶基因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，miRNA-204靶基因靶基因富集于21個(gè)基因功能(P<0.01)。miRNA-204靶基因富集在生物學(xué)過(guò)程：大腦發(fā)育、磷脂酰肌醇代謝過(guò)程、離子運(yùn)輸、蛋白質(zhì)運(yùn)輸、蛋白質(zhì)硫酸化、類固醇激素介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)、線粒體去極化、細(xì)胞對(duì)缺氧的反應(yīng)、GTP酶介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架組織等相關(guān)生物學(xué)過(guò)程。miRNA-204靶基因主要作用在：突觸后膜、高爾基體膜、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)等細(xì)胞組分。miRNA-204靶基因富集的分子功能包括：與蛋白質(zhì)結(jié)合和金屬離子結(jié)合、調(diào)控類固醇激素受體活性及GTPase活化劑活性(見(jiàn)圖1)。

圖1 miRNA-204靶基因富集分析

2.4 miRNA-204靶基因KEGG分析 miRNA-204靶基因主要富集在16條通路中(P<0.05)：Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路、磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)、神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路、鞘脂信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、鈣信號(hào)通路、Hippo信號(hào)通路、cGMP-PKG信號(hào)傳導(dǎo)通路、癌細(xì)胞膽堿代謝、血管平滑肌收縮、晝夜節(jié)律、胰腺分泌、唾液分泌等相關(guān)通路(見(jiàn)圖2)。

圖2 miRNA-204靶基因KEGG分析

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)研究利用基因芯片發(fā)現(xiàn)miRNA-204在氯化鋰-匹羅卡品癲癇小鼠海馬組織表達(dá)減少。已有研究報(bào)道與本實(shí)驗(yàn)基因芯片檢測(cè)結(jié)果相一致：Raoof R等[2]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-204在顳葉癲癇及癲癇持續(xù)狀態(tài)患者的腦脊液中表達(dá)顯著減少，Xiang等[3]研究也顯示在體外培養(yǎng)的癲癇持續(xù)狀態(tài)海馬神經(jīng)細(xì)胞中miRNA-204顯著下調(diào)，miRNA-204 通過(guò)調(diào)節(jié) TrkB 和下游ERK1/2-CREB信號(hào)通路在海馬神經(jīng)元模型中發(fā)揮抗癲癇作用。在Xia等[4]在膠質(zhì)細(xì)胞瘤繼發(fā)的癲癇腦組織中發(fā)現(xiàn)，miRNA-204表達(dá)水平明顯低于正常腦組織的表達(dá)量，并且發(fā)現(xiàn)miRNA-204可以顯著抑制了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲。

本實(shí)驗(yàn)研究中預(yù)測(cè)的miRNA-204靶基因的功能GO富集顯示：miRNA-204與大腦發(fā)育關(guān)系密切，相關(guān)研究也證實(shí)miRNA-204在神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中起關(guān)鍵作用，包括在軸突誘導(dǎo)控制中的作用和在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的重要作用[5]。miRNA-204在驚厥性腦損傷后表達(dá)顯著增加，可減少驚厥誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，加速神經(jīng)細(xì)胞軸突的生長(zhǎng)與延伸[6]。然而，一些研究也提示miRNA-204可導(dǎo)致大腦海馬神經(jīng)元突觸可塑性下降，影響海馬組織調(diào)控的認(rèn)知功能改變。隨著年齡增長(zhǎng)，海馬中miRNA-204表達(dá)上調(diào)，而EphB2和NR1表達(dá)降低，miRNA-204可通過(guò)調(diào)控EphB2和NR1影響海馬突觸可塑性下降，可能導(dǎo)致年齡相關(guān)認(rèn)知功能的改變[7]。在KEGG通路分析顯示miRNA-204靶基因富集于Wnt信號(hào)通路的有：AF366264、VANGL1、BTRC、PRKCG、FZD3、DAAM1、DAAM2、WNT2、MAP3K7、RAC2、SFRP1、PRICKLE2、PLCB1、FBXW11。

經(jīng)典Wnt/β-catenin通路調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)發(fā)生、突觸分裂和線粒體調(diào)節(jié)，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能至關(guān)重要[8]。相關(guān)的研究發(fā)現(xiàn)，β-catenin在對(duì)低氧發(fā)作反應(yīng)中出現(xiàn)巨大的轉(zhuǎn)錄變化，β-catenin在神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的形成和維持以及促進(jìn)突觸可塑性方面具有重要作用[9]。另一項(xiàng)研究通過(guò)使用Wnt通路抑制劑，減少了紅藻氨酸誘導(dǎo)小鼠癲癇發(fā)作次數(shù)，顯示了Wnt通路治療癲癇潛在有效性[10]。Wnt信號(hào)通路參與癲癇急性期和慢性期，誘發(fā)的神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)元死亡[11]，急性期癲癇發(fā)作時(shí)Wnt信號(hào)通路激活，導(dǎo)致了短暫的神經(jīng)代謝的改變，隨著癲癇發(fā)作的持續(xù)，Wnt信號(hào)通路將激活mTOR通路，導(dǎo)致癲癇慢性發(fā)作。癲癇發(fā)生的早期有一個(gè)治療窗口，Wnt信號(hào)通路啟動(dòng)了短暫的代謝，這一系列的代謝重組變化可能影響神經(jīng)異常發(fā)生和分化，從而影響癲癇敏感性[12]。同時(shí)值得注意的是，長(zhǎng)鏈非編碼RNA Uca1可以通過(guò)降低miRNA-375的水平來(lái)促進(jìn)Sfrp1的表達(dá)，進(jìn)而通過(guò)抑制Wnt/β-catenin通路的激活，抑制癲癇小鼠神經(jīng)元細(xì)胞的異常增殖，預(yù)防癲癇發(fā)作[13]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA Peg13可通過(guò)miRNA-490-3p/Psmd11軸抑制Wnt/β-catenin通路，減緩小鼠癲癇進(jìn)展[14]。

癲癇是最常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，在臨床中有許多患者對(duì)目前所有可用的治療藥物都有一定的耐藥性。現(xiàn)有的抗癲癇藥物治療主要是減少興奮和預(yù)防癲癇發(fā)作，但不能影響疾病的潛在病理生理。最近，有許多研究工作集中在確定抗癲癇治療的機(jī)制靶點(diǎn)，以防止慢性癲癇的進(jìn)展。在本實(shí)驗(yàn)中預(yù)測(cè)miRNA-204的靶基因富集功能和KEGG通路部分已經(jīng)被證實(shí)，其中Wnt/β-catenin信號(hào)通路可能是未來(lái)抗癲癇治療的十分有前景的癲癇治療靶點(diǎn)。本課題組將在以后的研究中對(duì)miRNA-204靶基因和Wnt/β-catenin信號(hào)通路完善相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究，進(jìn)一步驗(yàn)證其對(duì)癲癇發(fā)生發(fā)展的影響。