不同支氣管沖洗液結核分枝桿菌檢測法在菌陰肺結核診斷中的應用價值

高英姿

（武漢市新洲區中醫醫院，湖北 武漢 431400）

結核病是一種由結核分枝桿菌感染引起的慢性傳染病。結核病可累及患者全身的多個器官，其中累及肺部（肺結核）最為常見。結核病在臨床上多表現為慢性病程，少數患者可能存在急性起病的情況[1-2]。結核病的治療時間較長，抗結核藥物的副作用較大，易導致患者機體的免疫力下降，出現一些并發癥[3]。當前由于抗生素、糖皮質激素及免疫抑制劑的廣泛使用，導致結核分枝桿菌的耐藥性不斷增強。如何有效檢測并控制結核病已成為現階段臨床上討論的熱點問題[4-5]。菌陰肺結核是指至少經3 次痰涂片檢查及1次痰培養檢查結果呈陰性的一類肺結核[6-7]。作為菌陰肺結核臨床診斷的重要措施之一，支氣管鏡檢查不僅能直觀地觀察患者病灶的情況，還可取其支氣管沖洗液進行后續的實驗室檢查，為本病的診斷及治療提供重要的參考依據[8]。本文主要是探討不同支氣管沖洗液結核分枝桿菌檢測法在菌陰肺結核診斷中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2019 年12 月至2020 年12 月我院收治的60 例疑似患有菌陰肺結核的患者作為研究對象。其納入標準是：疑似患有菌陰肺結核，存在低熱、盜汗、納差、咳嗽、咳痰、胸痛、胸悶等癥狀，但無消瘦、咯血、乏力癥狀；臨床資料齊全；知曉本研究內容，并簽署了知情同意書。其排除標準是：患有活動性肺結核；合并有惡性腫瘤或其他嚴重的器質性疾病；存在心、肝、腎、腦等器官功能障礙；存在意識障礙或精神障礙，無法與醫護人員正常交流；中途退出本研究或存在其他可能對本研究結果造成影響的因素。在這些患者中，有男性患者33 例，女性患者27 例；其年齡為18 ～31 歲，平均年齡為（25.12±1.22）歲；其臨床癥狀持續的時間為1 ～27 個月，平均時間為（17.14±1.22）個月。

1.2 方法

1.2.1 支氣管鏡檢查 對60 例患者進行支氣管鏡檢查的方法是：對其進行局部麻醉，從鼻腔置入支氣管鏡。在支氣管鏡下對患者的肺部、支氣管黏膜等進行觀察，了解有無異常。經支氣管鏡的活檢孔用5 ～10mL 的生理鹽水沖洗肺臟和支氣管，隨后利用吸引器將沖洗液吸出并置入標本瓶中。

1.2.2 結核分枝桿菌培養 對60 例患者均進行結核分枝桿菌培養，采用全自動結核分枝桿菌培養檢測儀實施標本培養及病原菌分離等操作。取患者的支氣管沖洗液標本，在血平板與麥康凱平板上接種標本，置于25℃的恒溫箱中培養18 ～24 h，觀察標本中菌落生長的情況，之后開展革蘭染色、菌種分離與鑒定等操作。

1.2.3 涂片法采用涂片法 對患者的支氣管沖洗液進行檢測的方法是：取支氣管沖洗液標本，將其均勻涂抹于載玻片上，之后采用萋- 尼氏染色抗酸染色法進行抗酸桿菌檢測。當持續觀察300 個視野發現3 條或3 條以上的抗酸桿菌時，可判斷檢測結果呈陽性，反之則表示檢測結果呈陰性。

1.2.4 噬菌體生物擴增法 采用噬菌體生物擴增法對患者的支氣管沖洗液進行檢測的方法是：用結核分枝桿菌檢測試劑盒進行檢測，嚴格按照試劑盒的說明書進行各項檢測操作。陽性結果判讀：1）噬菌體斑融合，并表現為透明狀；2）噬菌斑數量＞20 個。上述條件符合其中任意1 條，即可判斷檢測結果呈陽性。1.2.5 熒光定量PCR 法 采用熒光定量PCR 法對患者的支氣管沖洗液進行檢測的方法是：取支氣管沖洗液標本，對其進行離心處理，取上清液。將上清液反復沉淀后與無菌生理鹽水混合，置于PCR 反應管中實施定量PCR 擴增處理，最后利用KAPA 定量熒光PCR 法對結核分枝桿菌基因的數量進行測定。陽性結果判讀：若結核分枝桿菌基因數量超過1×103拷貝/mL，則可判斷檢測結果呈陽性。

1.3 觀察指標

觀察對60 例患者進行結核分枝桿菌培養的結果。觀察用涂片法、噬菌體生物擴增法和熒光定量PCR法對60 例患者的支氣管沖洗液進行檢測的結果。比較用涂片法、噬菌體生物擴增法和熒光定量PCR 法診斷菌陰肺結核的效能。

1.4 統計學方法

用SPSS 20.0 軟件處理本研究中的數據，計數資料用% 表示，用χ2 檢驗，計量資料用均數± 標準差（±s）表示，用t檢驗，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對60 例患者進行結核分枝桿菌培養的結果

對本研究中60 例患者進行結核分枝桿菌培養的結果顯示，其中有24 例患者的培養結果呈陽性（表示其患有菌陰肺結核），其余36 例患者的培養結果均呈陰性（表示其患有其他疾病）。

2.2 用涂片法、噬菌體生物擴增法和熒光定量PCR法對60 例患者的支氣管沖洗液進行檢測的結果

采用涂片法對60 例患者的支氣管沖洗液進行檢測的結果顯示，其中有23 例患者的檢測結果呈陽性（表示其患有菌陰肺結核），其余37 例患者的檢測結果均呈陰性（表示其患有其他疾病）。采用噬菌體生物擴增法對60 例患者的支氣管沖洗液進行檢測的結果顯示，其中有24 例患者的檢測結果呈陽性（表示其患有菌陰肺結核），其余36 例患者的檢測結果呈陰性（表示其患有其他疾病）。采用熒光定量PCR 法對60 例患者的支氣管沖洗液進行檢測的結果顯示，其中有27 例患者的檢測結果呈陽性（表示其患有菌陰肺結核），其余33 例患者的檢測結果呈陰性（表示其患有其他疾病）。詳見表1。

表2 用涂片法、噬菌體生物擴增法和熒光定量PCR 法對60例患者的支氣管沖洗液進行檢測的結果（例）

2.3 用涂片法、噬菌體生物擴增法和熒光定量PCR 法診斷菌陰肺結核的效能

用涂片法診斷60 例患者菌陰肺結核的敏感度為91.67%（22/24）、特異度為97.22%（35/36）、準確率為95.00%（57/60）。用噬菌體生物擴增法診斷60例患者菌陰肺結核的敏感度為87.50%（21/24）、特異度為91.67%（33/36）、準確率為90.00%（54/60）。用熒光定量PCR 法診斷60 例患者菌陰肺結核的敏感度為58.33%（14/24）、特異度為63.89%（23/36）、準確率為61.67%（37/60）。用涂片法、噬菌體生物擴增法診斷60 例患者菌陰肺結核的敏感度、特異度、準確率與結核分枝桿菌培養法的一致性較好，效果較佳，顯著優于熒光定量PCR 法。

3 討論

肺結核是一種危害較大的慢性傳染病[9-10]。此病的傳播特點是：1）傳染性強。作為一種傳染性強的疾病，肺結核的傳播途徑主要是飛沫傳染[11]。肺結核患者在打噴嚏、咳嗽或說話時，都有可能將帶有結核分枝桿菌的飛沫傳播到空氣中，健康人在呼吸到被污染的空氣之后，就可能發生結核分枝桿菌感染。2）傳播速度快。結核分枝桿菌在傳播的過程中，若傳播途徑合適，且患者存在易感體質，結核分枝桿菌就會在短時間內侵入易感人群（如體質較差的嬰幼兒、老年人及營養不良者）的體內，其傳播速度較快[12]。3）傳播的范圍廣。肺結核患者的病情在確診之前，會有一段時間的潛伏期。由于本病的傳染性較強，且結核分枝桿菌在進入外界環境中也可以長時間存活，因此不需要被感染者與感染者有直接身體接觸便可能發生感染[13]。在肺結核診治的過程中，早期明確診斷此病對治療方案的選擇及提高患者的療效具有重要的意義[14]。菌陰肺結核患者在患病的早期缺乏特異性的臨床表現，且對其進行實驗室檢查的結果可能呈陰性，因此其病情在持續進展后可能會出現嚴重的并發癥狀。因此，臨床上對菌陰肺結核進行準確的診斷和及時的治療至關重要。對菌陰肺結核患者進行支氣管鏡檢查可直觀地觀察其病灶的情況，還可利用生理鹽水沖洗其支氣管和肺部，采集沖洗液開展細胞學檢查，進而有助于診斷其病情。目前臨床上對菌陰肺結核患者的支氣管沖洗液進行檢測的方法較多，包括涂片法、噬菌體生物擴增法和熒光定量PCR 法等。涂片法屬于細菌學檢查中最基礎的一種方法，即利用石碳酸復紅進行初染，隨后用鹽酸、酒精處理，用堿性美藍進行復染，此時標本中若含有結核分枝桿菌，則會表現為紅色。在結核分枝桿菌的細胞壁中，肽聚糖外周存在大量的脂肪，著色較為困難，且用酸性脫色劑脫色也較為困難，因此通過染色能有效判斷標本中是否存在結核分枝桿菌。熒光定量PCE 法即利用熒光標記的寡核苷酸探針或熒光染料，對結核分枝桿菌中的某一特定核酸序列DNA 拷貝數量實施迅速擴增，隨后臨床醫師利用DNA 探針、PCR 雜交技術對熒光的變化進行觀察，并記錄NDA 模板定量，從而實現結核分枝桿菌檢測的一種方法。但該檢測方法對檢驗人員的技術水平、專業知識及經驗的要求較高，同時需要有專業的檢測設備，故不利于在基層醫院推廣。噬菌體生物擴增法是一種檢測結核分枝桿菌是否存活或耐藥的方法。其檢測原理是，利用恥垢分枝桿菌作為輔助細菌，在結核分枝桿菌內增殖的子代噬菌體釋放出來后感染、裂解恥垢分枝桿菌，根據24h 內是否形成清晰的噬菌斑來判斷是否存在結核分枝桿菌活菌，以及結核分枝桿菌是否耐藥。該檢測方法對檢驗人員技術水平和檢測設備的要求均較低，且在24h 左右便可得出檢測結果，具有較好臨床應用前景。在采用噬菌體生物擴增法檢測結核分枝桿菌時，若檢測結果出現誤差，可能與標本采集不當、患者感染的時間短、活性菌數量較少及噬菌體的濃度等存在一定的關系。

本研究的結果證實，采用涂片法、噬菌體生物擴增法對菌陰肺結核患者的支氣管沖洗液進行檢測的效果較佳，臨床診斷價值較高，而用熒光定量PCR 法對此病患者的支氣管沖洗液進行檢測則存在一定的誤差性。本研究也存在一定的不同之處，例如部分患者的遵醫囑性較差，影響其檢測結果；樣本量小，研究時間較短等。因此，在后期的研究中應加強與患者進行溝通，使其能夠積極地配合研究與治療，并延長研究時間，加大樣本量，為菌陰肺結核的臨床診治提供更科學的數據。