福州市動(dòng)物園野生鳥類與周邊活禽市場禽類H9 亞型低致病性禽流感病毒感染的監(jiān)測與分析

那 洋 福州市動(dòng)物園 福州 350012

依據(jù)禽流感病毒的致病性， 可分為低致病性禽流感病毒（LP-AIV）和高致病性禽流感病毒（HPAIV）。 低致病性禽流感通常不引起家禽大批量死亡，癥候群一般為輕微的呼吸道癥狀或產(chǎn)蛋率下降，精神食欲不佳等[1]，但感染后常常引發(fā)免疫力下降，伴隨繼發(fā)、并發(fā)感染，這時(shí)病死率最高可達(dá)97%。 因此，低致病性禽流感對(duì)養(yǎng)殖業(yè)的危害不容忽視[2-3]。通過對(duì)高致病性禽流感流行病學(xué)的調(diào)查顯示， 大多數(shù)傳染源都來自野鳥或者水禽[3-4]。

PCR 檢測原理：將由病毒RNA 反轉(zhuǎn)的cDNA 作為模板，并設(shè)計(jì)出模板上的一段保守蛋白作為引物，DNA 在PCR 儀中呈指數(shù)增加。 若在后續(xù)電泳中出現(xiàn)引物的相應(yīng)擴(kuò)增條帶，則為陽性。 多重PCR 技術(shù)的問世解決了禽流感多種亞型以及共感染鑒別檢測復(fù)雜性的問題[5]。 多重PCR 是指在反應(yīng)系統(tǒng)中加入多個(gè)引物， 可同時(shí)擴(kuò)增出相應(yīng)的核酸片段。 我國學(xué)者在前人研究基礎(chǔ)上建立了禽流感病毒HA 與M基因的多重PCR 技術(shù)，可檢測出目前已知的所有禽流感亞型，其靈敏性可檢測低至1 ng 的RNA 水平[6-8]。

本試驗(yàn)對(duì)福州市動(dòng)物園野生鳥類以及周邊部分活禽市場禽糞便棉拭子取樣， 進(jìn)行H9N2 亞型禽流感病毒檢測。 福州市位于低緯度沿海地區(qū)， 屬于亞熱帶海洋性季風(fēng)氣候， 是大量鳥類遷徙路線的中轉(zhuǎn)站，福州市動(dòng)物園禽類種類繁多，常有救濟(jì)站或遷徙途中受傷候鳥收養(yǎng)于園中；福州市區(qū)內(nèi)人口基數(shù)大，畜禽混養(yǎng)，活禽市場眾多，消費(fèi)者與活禽接觸密切。之前， 沒有針對(duì)福州市動(dòng)物園禽類低致病性禽流感病毒感染情況進(jìn)行調(diào)查并將結(jié)果與周邊活禽市場禽類檢測情況進(jìn)行對(duì)比。 本試驗(yàn)結(jié)果有助于動(dòng)物園進(jìn)行禽流感早期檢測預(yù)防、 追蹤低致病性禽流感的傳染源及影響因素， 有助于動(dòng)物園制定完善的防控措施。

1 禽流感樣本采集

于2016 年10 月至11 月共計(jì)采樣361 份，均為糞便棉拭子樣品。 其中動(dòng)物園采樣共155 份， 包括9 目13 科23 種，具體種屬及樣本數(shù)量見表1；活禽市場采樣206 份，主要為雁形目（Anseriformes）與雞形目（Galliformes），包括77 份家鴨樣品、98 份家雞樣品、31 份肉用雁鵝樣品。

2 禽流感病毒M 基因RT-PCR 檢測結(jié)果與病毒亞型鑒定

運(yùn)用RT-PCR 對(duì)361 份糞便棉拭子進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)8 目127 羽份禽類攜帶禽流感病毒， 平均感染率為35.18%，動(dòng)物園采樣中鴿形目的病毒感染率最高（53.33%），其次為雞形目（49.35%）。 活禽市場采樣中雀形目的感染率最高（46.75%），其次為雞形目（29.17%）。動(dòng)物園中檢出4 例H9N2 陽性，活禽市場所采樣中暫未發(fā)現(xiàn)H9N2 亞型陽性。 各特異性引物RT-PCR 電泳結(jié)果見圖1。

表1 動(dòng)物園采樣種屬及數(shù)量

圖1 各特異性引物陽性及陰性對(duì)照PCR 電泳圖

將動(dòng)物園采集的樣品進(jìn)行RT-PCR 檢測，M 基因與H9 以及N2 亞型同時(shí)出現(xiàn)陽性條帶， 判定為H9N2 亞型禽流感陽性，見圖2。

將活禽市場采集的樣品進(jìn)行RT-PCR 檢測，M基因與其他亞型同時(shí)出現(xiàn)陽性條帶， 判定為相應(yīng)亞型禽流感陽性，見圖3。

圖2 動(dòng)物園采樣RT-PCR 示例圖

圖3 活禽市場采樣RT-PCR 示例圖

病毒M 基因陽性鳥種與陽性率，見表2。

3 討 論

表2 病毒M 基因陽性鳥種與陽性率

3.1 福州市動(dòng)物園禽類AIV 傳播趨勢情況分析本研究主要針對(duì)動(dòng)物園野生鳥類及周邊活禽市場禽類低致病性禽流感病毒代表亞型H9N2 的感染情況進(jìn)行調(diào)查。 共檢測361 份糞便拭子，均為2016 年秋季取樣。 采樣種類較多、總體數(shù)量較少，但其結(jié)果基本能代表市區(qū)動(dòng)物園野生鳥類和周邊活禽市場禽類禽流感病毒感染情況。

目前所得128 例M 基因陽性樣本中，動(dòng)物園有4 例H9N2 亞型， 其中3 例為雞形目； 活禽市場0例。 動(dòng)物園與活禽市場最高兩目禽的感染率對(duì)比見圖4。 推測原因?yàn)橐吧綦u的生活及覓食習(xí)性與動(dòng)物園飼養(yǎng)環(huán)境相近， 導(dǎo)致低致病性禽流感病毒更易攜帶、傳播；周邊活禽市場的家禽主要來自規(guī)模化養(yǎng)殖場，攜帶病毒的可能性較小。

圖4 禽類感染率最高及次高柱形比較圖

3.2 本地區(qū)動(dòng)物園禽流感傳播風(fēng)險(xiǎn)與防控措施從流行病學(xué)檢測結(jié)果分析， 本地區(qū)動(dòng)物園內(nèi)禽流感陽性率高于同種類全球平均陽性率。 據(jù)以往病例分析，近年來未發(fā)現(xiàn)動(dòng)物園內(nèi)禽類禽流感死亡病例，但偶發(fā)性出現(xiàn)低致病性禽流感相應(yīng)臨床癥狀， 與本次調(diào)查結(jié)果相符。 低致病性禽流感雖較少引起大批量死亡現(xiàn)象，但容易與其他病原共感染。

現(xiàn)有調(diào)查數(shù)據(jù)顯示， 周邊活禽市場禽的低致病性禽流感感染率小于動(dòng)物園內(nèi)現(xiàn)有的禽類， 因此推測動(dòng)物園的主要傳染源有可能來自遷徙候鳥、 救助站救助的野生禽類。 建議對(duì)動(dòng)物園內(nèi)現(xiàn)有禽類進(jìn)行遷徙候鳥保護(hù)措施，密切檢測“非法入境者”，對(duì)被救助禽類進(jìn)行全面隔離和檢測[9-10]。

鑒于此次調(diào)查范圍較小，也未對(duì)RT-PCR 結(jié)果進(jìn)行測序， 不能完全推測該地區(qū)禽流感病毒感染情況、流行株基因遺傳特征及流行演變趨勢。擬進(jìn)行后續(xù)研究， 將測序結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫Genbank 進(jìn)行同源性比對(duì)，不同時(shí)間、季節(jié)采樣，擴(kuò)大采樣數(shù)量，深入進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查。將園內(nèi)現(xiàn)有野生禽類保護(hù)好，真正做到防患于未然， 發(fā)揮流行病學(xué)監(jiān)測的預(yù)防與預(yù)警作用。