福建省某規(guī)模化豬場三種病毒性疫病抗體監(jiān)測和病原檢測分析

駱 鈺 南平市延平區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 福建南平 353000

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）、 偽狂犬?。≒seudorabies，PR）和豬瘟（Classical Swine Fever，CSF）是當(dāng)前我國開展“規(guī)?；i場主要動物疫病凈化示范場”和“規(guī)?；i場主要動物疫病凈化創(chuàng)建場”評估認證工作中必檢的幾種傳染性病毒病， 也是規(guī)?；i場最常見的幾種主要病毒性疫病[1]。其中PRRS(俗稱藍耳病)以妊娠母豬的繁殖障礙(流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎)及各種年齡豬特別是仔豬的呼吸道疾病為特征[2]；PR又名狂癢病、皰疹病毒病和阿捷申氏病等，是由偽狂犬病病毒（Pseudorabies Virus，PRV）引起的多種動物共患的急性傳染病[3]；CSF 是由豬瘟病毒（Classical Swine Fever Virus，CSFV）引起的一種急性、熱性、高度接觸性、致死性傳染病，是嚴重危害 養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的一種烈性傳染病[4]。 感染PRRS、PRV、CSFV 或造成免疫抑制，對生長性能造成抑制，嚴重影響?zhàn)B殖戶的經(jīng)濟效益， 阻礙養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)進一步發(fā)展并造成巨大經(jīng)濟損失， 甚至還會導(dǎo)致家畜及其產(chǎn)品的國際貿(mào)易受阻[2,5-6]。

因此， 做好上述幾種病毒性疫病的抗體監(jiān)測與病原檢測分析十分必要。 為監(jiān)測和評估福建省某規(guī)模化豬場豬群健康狀況， 該豬場采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）分別對PRRS、PR 和CSF 進行抗體監(jiān)測，同時，采用實時熒光PCR/RT-PCR 試驗方法，取患豬組織進行病原檢測。根據(jù)試驗結(jié)果，能夠?qū)ωi群疫苗免疫效果進行實時評估， 有利于進一步完善該豬場的疫苗免疫程序及疫病凈化方案。

1 試驗材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清 從該豬場隨機選取保育豬10 頭，分別于20 日齡、40 日齡和60 日齡時采集血清。 經(jīng)調(diào)查，該豬場免疫程序見表1。

1.1.2 組織樣本 檢測藍耳病、 偽狂犬病的肺臟和檢測豬瘟的脾臟，均來自該豬場40~50 日齡患豬。

1.1.3 試劑盒 豬繁殖與呼吸綜合征/豬藍耳?。≒RRS XR）抗體ELISA 試劑盒、豬偽狂犬病gB（PR gB） 抗體ELISA 檢測試劑盒和豬瘟 （CSF） 抗體ELISA 檢測試劑盒均購自BioChek BV，The Netherlands； 豬偽狂犬病抗體檢測試劑盒購自IDEXX；核酸提取試劑盒、豬藍耳病病毒通用型（PRRSV-U）核酸檢測試劑盒（熒光PCR 法）、 偽狂犬病病毒通用（PRV-gH）核酸檢測試劑盒（熒光PCR 法）和豬瘟病毒（CSFV）核酸檢測試劑盒（熒光PCR 法）均購自廣州維伯鑫股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 血清抗體檢測 分別于該豬場保育豬20 日齡、40 日齡和60 日齡時采集血清各10 份并按200109-流水號（200109-01、200109-02......200109-30）進行編號，于3 000 r/min 離心5 min 分離血清。分離的血清樣本按照編號順序按抗體檢測試劑盒說明書操作，分別檢測PRRS、PR gB、PR gE 和CSF 的抗體水平并對結(jié)果進行判定。

1.2.2 核酸提取 分別取10 頭40~50 日齡剖檢患豬的脾臟和肺臟，分別將10 份脾臟和肺臟組織混合后磨碎， 根據(jù)廣州維伯鑫股份有限公司生產(chǎn)的核酸提取試劑盒說明書提取核酸。

1.2.3 實時熒光PCR/RT-PCR 檢測 將肺臟組織提取的核酸分別按照豬藍耳病病毒通用型（PRRSV-U）核酸檢測試劑盒（熒光PCR 法）和偽狂犬病病毒通用 （PRV-gH） 核酸檢測試劑盒 （熒光PCR 法）說明書操作進行檢測，觀察各標(biāo)準(zhǔn)曲線和Ct 值進行判定；將脾臟組織提取的核酸按照豬瘟病毒（CSFV）核酸檢測試劑盒(熒光PCR 法)說明書操作進行檢測，觀察各標(biāo)準(zhǔn)曲線和Ct 值進行判定。

2 結(jié)果與分析

2.1 血清抗體檢測結(jié)果 30 份血清PRRS、PR gE、PR gB 和CSF 抗體檢測結(jié)果見表2、圖1。 該豬場的PRRS 抗體陽性率從20 日齡的50.00%升高到60 日齡的100%，然而該豬場未免疫過PRRS 疫苗，表明該豬場存在PRRS 野毒感染的可能性。 由于PR gE抗體檢測試劑盒檢測的抗體均為野毒感染的抗體，由于該豬場隨機選擇的10 頭保育豬20~60 日齡均未檢測出PR gE 抗體， 表明該豬場不存在PR 感染的風(fēng)險。 PR gB 抗體檢測試劑盒檢測的抗體均為疫苗免疫抗體， 該豬場隨機選擇的10 頭保育豬20 日齡、40 日齡和60 日齡PR gB 抗體分別為100.00%、100.00%和0.00%， 表明該豬場PR gB 抗體在40~60 日齡時急劇降低。 CSF 抗體由60.00%上升至100.00%。經(jīng)了解，該豬場于適當(dāng)日齡免疫過CSF 疫苗， 抗體監(jiān)測結(jié)果顯示該疫病的整體抗體陽性率較高，說明該豬場的CSF 疫苗免疫能夠?qū)ιi提供保護，疫苗免疫效果較好。

由PRRS、PR gE、PR gB 和CSF 抗體檢測水平折線圖表明，隨著日齡增長，PRRS 和CSF 抗體呈上升趨勢，PR gE 抗體一直保持在陰性水平，而PR gB抗體在40 日齡后有明顯下降趨勢。 該結(jié)果與PRRS、PR gE、PR gB 和CSF 抗體檢測陽性率趨勢一致。

圖1 PRRS、PR gE、PR gB 和CSF 抗體檢測水平

2.2 PRRSV、PRV 和CSFV 實時熒光PCR/RTPCR 檢測 將肺臟組織提取的核酸分別按照豬藍耳病病毒通用型（PRRSV-U）核酸檢測試劑盒（熒光PCR 法）和偽狂犬病病毒通用（PRV-gH）核酸檢測試劑盒（熒光PCR 法）檢測，結(jié)果見圖2-圖3。 由圖2 可知，陽性對照的Ct 值≤35，且曲線為明顯的指數(shù)增長曲線，陰性對照無Ct 值，二者均成立判定試驗成立； 肺臟組織提取的核酸檢測PRRSV Ct 值=26.4，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線，表明該樣品為PRRSV 陽性。 由圖3 可知，陽性對照的Ct 值≤35，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線， 陰性對照無Ct 值，二者均成立判定試驗成立； 肺臟組織提取的核酸檢測PRV 無Ct 值，表明該樣品為PRV 陰性。

表1 豬場3 種病毒性疫病免疫程序

表2 PRRS、PR gE、PR gB 和CSF 抗體檢測情況

該豬場通過免疫接種，PR gE 抗體未被測出，已在該豬場很好地控制了PR，目前感染風(fēng)險較低。 說明目前在養(yǎng)豬領(lǐng)域主要采用的PRV gE 基因缺失活疫苗仍對本場具有較好的保護力[7]。

將脾臟組織提取的核酸按照豬瘟病毒（CSFV）核酸檢測試劑盒（熒光PCR 法）說明書操作進行檢測，結(jié)果見圖4。 陽性對照的Ct 值≤35，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線，陰性對照無Ct 值，二者均成立判定試驗成立， 脾臟組織提取的核酸檢測CSFV 無Ct 值，表明該樣品為PRV 陰性。

圖2 PRRSV 實時熒光RT-PCR 檢測結(jié)果

圖3 PRV 實時熒光PCR 檢測結(jié)果

圖4 CSFV 實時熒光PCR 檢測結(jié)果

綜 上 所 述，PRRSV、PRV 和CSFV 實 時 熒 光PCR/RT-PCR 檢測結(jié)果表明，被檢樣本有PRRSV 野毒感染情況，而無PRV 和CSFV 感染情況。

3 討 論

本試驗采用ELISA 和實時熒光PCR/RT-PCR方法對豬場豬群健康狀態(tài)開展檢測分析， 通過檢測分析充分掌握了該豬場PRRS、PR 和CSF 免疫抗體水平和野毒感染情況。 結(jié)果表明：該豬場PR 和CSF免疫抗體水平較高，陽性率高，說明疫苗免疫效果較好，建議該豬場今后繼續(xù)加強疫苗免疫；但PR 免疫抗體水平監(jiān)測表明，豬群于60 日齡時，抗體水平急劇下降，陽性率為0%，因此，有必要調(diào)整豬場的免疫程序， 于40~60 日齡時提早PR 疫苗加強免疫；PRRS 的野毒感染抗體檢測結(jié)果顯示， 該豬場存在PRRSV 野毒感染的風(fēng)險，經(jīng)實時熒光PCR/RT-PCR檢測結(jié)果表明， 該豬場存在PRRSV 野毒感染的情況[8]。

PRRSV 是一種單股正鏈RNA 病毒， 其開放閱讀框下GP5 蛋白是PRRSV 中最容易發(fā)生變異的蛋白質(zhì)之一[9]。 因PRRSV 變異迅速，同時能造成豬場免疫抑制， 使得目前對于PRRS 的防控依舊較為困難。 高致病性毒株減毒活疫苗的無序使用造成減毒活疫苗病毒的大量傳播， 使得PRRS 仍然是嚴重危害中國養(yǎng)豬業(yè)的重要疫病之一。據(jù)楊漢春等[10]報道，國內(nèi)PRRS 抗體總陽性率為64.61%，各地區(qū)抗體平均陽性率介于20%~100%，2021 年P(guān)RRS 減毒活疫苗的使用量下降，VR-2332 活疫苗的使用量有所增長。

該豬場未選用市面上常見的PRRS 疫苗對豬群進行免疫，是出于一種疫病凈化的策略。現(xiàn)階段因豬場非洲豬瘟防控力度較大， 規(guī)?；i場均搭建了系統(tǒng)性的生物安全防控體系。該體系的建立，不僅能夠?qū)Ψ侵挢i瘟進行防控， 對多種傳染性疾病也有很好的防控效果。 由于該場目前PRRSV 感染情況較為嚴重，需要盡快開展PRRS 凈化工作，包括淘汰陽性豬只、做好豬舍消毒、采用批次化養(yǎng)殖手段、切斷病毒在豬舍間的間接傳播途徑，引進PRRS 陰性豬，對后備豬群進行替換， 定期使用檢測手段檢測抗原抗體水平，堅持對多項傳染性疾病長期監(jiān)測，以求達到CSF、PR 等疫病免疫凈化及PRRS 非免疫凈化的效果。